猪骨蛋白酶解液美拉德反应产物的抗氧化活性研究

唐宏刚，肖朝耿，叶梦迪，朱培培，陈黎洪*（浙江省农业科学院食品科学研究所，浙江杭州310021）

猪骨蛋白酶解液美拉德反应产物的抗氧化活性研究

唐宏刚，肖朝耿，叶梦迪，朱培培，陈黎洪*
（浙江省农业科学院食品科学研究所，浙江杭州310021）

以猪骨蛋白酶解液和葡萄糖（或木糖）为原料，100℃水浴加热120 min以制备美拉德反应产物，采用超滤分离产物获得不同分子量范围（＜1、1～5、5～10、＞10 ku）的组分，研究各分离组分的体外抗氧化活性。结果表明，不同组分均具有一定的抗氧化活性，其中分子量＞10 ku的组分具有较高的DPPH自由基清除能力、还原能力以及Fe2+螯合活性，表明高分子量美拉德反应产物的抗氧化能力更强。葡萄糖、木糖组产物的自由基清除能力、还原能力以及Fe2+螯合活性差异均不显著（P＞0.05），说明还原糖结构对该研究制备的美拉德反应产物的抗氧化活性未产生明显影响。

猪骨蛋白酶解液；美拉德反应产物；抗氧化活性

中国是世界第一肉类生产大国，年总产量超8 000万t，其中，畜禽鲜骨达2 000多万t。研究表明，骨中的蛋白质和脂肪含量与等量鲜肉相似，钙、磷等矿物元素的比例合理，并富含磷脂质、磷蛋白、维生素等，是一类营养价值相当高的畜禽副产品［1］。骨蛋白是较为全价的可溶性蛋白质，氨基酸比例均衡，生物学效价高，属于优质蛋白［2］。国内外学者针对畜禽骨蛋白的利用研究主要集中在蛋白提取及酶解条件参数的优化、酶解产物功能特性与活性分析等，并取得了较大进展［3-5］。

美拉德反应是指含游离氨基的化合物与含羰基化合物之间的非酶促褐变反应，广泛存在于食品的贮藏与加工过程［6］。美拉德反应产物（Maillard reaction products，MRPs）中含有类黑精、还原酮类及一系列挥发性杂环化合物，其中，呈褐色的高分子量成分——类黑精对产物的色泽与抗氧化活性具有重要的贡献［7］。研究表明，动物蛋白酶解物可与还原糖进行美拉德反应，其产物除呈现一定的风味特征外，还具有较好的体外抗氧化活性［8-10］。

目前，畜禽骨蛋白水解物与还原糖的美拉德反应产物的抗氧化特性已有报道［11］，而对产物中不同分子量组分的抗氧化活性缺乏深入研究。本研究以资源丰富的猪骨为原料制备蛋白酶解液，并与不同结构的还原糖进行美拉德反应，采用膜分离手段获得不同分子量范围的反应产物组分，通过体外试验研究各组分的抗氧化活性。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

猪骨购于食品市场；中性蛋白酶购于无锡杰能科生物工程有限公司；风味蛋白酶购于诺维信公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）购于Sigma-Aldrich公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 猪骨蛋白酶解液美拉德反应产物的制备

猪骨蛋白酶解液（PBPH）制备：猪骨经清洗、破碎后高压蒸煮，然后进行离心分离、浓缩、去脂，采用m（中性蛋白酶）∶m（风味蛋白酶）=2∶1的复合酶进行酶解，其酶解条件为料液比1∶5，加酶量3%，pH 7.0，酶解温度45℃，时间3 h。酶解结束后灭酶、离心，取上清液。

美拉德反应产物制备：取定量葡萄糖（或木糖）与猪骨蛋白酶解液作为反应底物，混合搅拌均匀，用1 mmol·L-1NaOH调整溶液初始pH值至7.8，再转移至具塞玻璃试管中，置于100℃水浴加热120 min。

1.3 不同分子量范围MRPs的分离

将所制备的产物用冰水浴降温，1 500 g离心15 min。通过实验用膜分离装置MSM-1812（上海摩速科学器材有限公司）以中空纤维超滤膜对MRPs进行超滤处理，选择的滤膜截留分子量分别为1、5、10 ku，至少重复3次。获得的不同分子量范围组分经旋转蒸发浓缩，再冷冻干燥，4℃保存用于分析。

1.4 DPPH自由基清除率

参照Tepe等［12］的方法并作适当修改。取0.2 mL待测MRPs样品溶液（浓度10 mg·mL-1，加入0.8 mL 0.2 mmol·L-1DPPH甲醇溶液，混匀，在室温下置于暗处反应30 min，测定其517 nm处的吸光度。按照公式（D0-D1）/D0×100计算清除率，其中D0指不加入样品时的吸光度，D1为加入样品后的吸光度。

1.5 超氧阴离子清除能力

参考Marklund等［13］的方法测定。取0.1 mL MRPs样品溶液，加入2.8 mL 0.1 mol·L-1Tris-HCl缓冲溶液（pH 8.2），混匀后25℃水浴保温10 min。然后加入0.1 mL经25℃水浴预热的3 mmol·L-1邻苯三酚溶液，混匀并计时，测定325 nm处吸光度，空白管以蒸馏水代替。每隔30 s读取1次，5 min后结束，计算邻苯三酚的自氧化速率。按公式（V0-Vi）/V0×100计算邻苯三酚自氧化的抑制率，其中，V0为空白组邻苯三酚自氧化速率（ΔD/min）；Vi为加入样品后邻苯三酚的自氧化速率（ΔD/min）。

1.6 还原能力

参照Oyaizu［14］的方法并略作改动。取1 mL MRPs样品溶液，依次加入2.5 mL磷酸盐缓冲液（0.2 mol·L-1，pH 6.6）和2.5 mL铁氰化钾溶液（1 g·100mL-1）。将混匀的溶液于50℃水浴中保温20 min，迅速冷却，加入2.5 mL三氯乙酸溶液（10 g·100mL-1），混匀后离心10 min。取2.5 mL上清液，加入0.5 mL三氯化铁溶液（0.1 g· 100mL-1）和2.5 mL蒸馏水摇匀，静置10 min后，在700 nm波长处测定吸光度。

1.7 Fe2+螯合活性

参考Dinis等［15］的方法并稍作修改。取 1 mL样品溶液，加入1.85 mL蒸馏水与0.05 mL 2 mmol·L-1FeCl2溶液，混匀静置30 s。然后再加入0.1 mL 5 mmol·L-1菲洛嗪溶液并混匀，反应10 min，于562 nm处测定吸光度。Fe2+螯合活性计算方法为螯合活性（%）=（1-DS/DB）×100，其中DS、DB分别为样品、空白组的吸光值。

1.8 数据分析

采用SPSS 13.0软件，对数据进行差异显著性方差分析（P＜0.05表示差异显著）。

2 结果与分析

2.1 DPPH自由基清除率

DPPH是衡量各种抗氧化物质清除自由基能力的常用反应底物。DPPH自由基在甲醇溶液中比较稳定，当从加入的抗氧化剂中接收电子或者氢原子，自由基将被清除，从而导致517 nm处的吸光度下降［16］。在本研究中，分子量＞10 ku的组分 DPPH自由基清除率最高（57.25% ～59.42%），但5～10 ku组分DPPH自由基清除率相对最低（39.64%～41.21%）（图1）。MRPs中具有DPPH自由基清除作用的有效成分主要为水溶性物质而非醇溶性［17］，因此，推测5～10 ku组分中醇溶性物质含量较高。鉴于产物组分的复杂性，具体原因有待于进一步分离并深入研究。经统计分析，葡萄糖、木糖组的产物DPPH自由基清除率差异不显著（P＞0.05），表明还原糖结构对猪骨蛋白酶解液美拉德反应产物的DPPH自由基清除能力未产生明显影响。

2.2 超氧阴离子清除能力

图1 猪骨蛋白酶解液美拉德反应产物的DPPH自由基清除率Fig.1 DPPH radical scavenging pecentage of MRPs derived from PBPH

2.3 还原能力

还原能力是评判物质抗氧化活性高低的重要指标，一般与抗氧化能力呈正相关。在还原力测定过程中，样品还原剂将3价铁离子（Fe3+）/铁氰化物复合物转变为亚铁离子（Fe2+）形式，Fe2+的产生通过测定 700 nm处吸光值进行检测［20］。

图2 猪骨蛋白酶解液美拉德反应产物的超氧阴离子清除能力Fig.2 Superoxide radical scavenging ability of MRPs derived from PBPH

由图3可以看出，不同分子量范围的猪骨蛋白酶解液美拉德反应产物均具有一定的还原能力，其中，分子量＞10 ku的组分还原力较强，葡萄糖、木糖组D700分别为0.651和0.694。已有研究发现，高分子量的类黑精组分具有更高的褐变程度和还原能力［21］，这在本研究中也得到了证实。与DPPH自由基、超氧阴离子清除能力类似，木糖组产物的还原能力在数值上高于葡萄糖组，但差异不显著（P＞0.05）。

2.4 Fe2+螯合活性

金属离子可催化超氧阴离子产生羟自由基，加快机体氧化衰老进程；而抗氧化剂能够通过螯合金属离子抑制自由基形成。不同分子量范围猪骨蛋白酶解液美拉德反应产物的Fe2+螯合活性见表1。从表1可以看出，随着分子量增加，Fe2+螯合活性呈上升趋势，分子量＞10 ku组分的螯合活性显著高于其他范围的组分（P＜0.05）。在相同分子量范围内，木糖与葡萄糖组产物组分的Fe2+螯合活性没有显著差异（P＞0.05）。Gu等［22］研究表明，酪蛋白—葡萄糖MRPs超滤后所得的高分子量（＞30 ku）组分螯合Fe2+作用较强，低分子量组分则不具有螯合活性。在本研究中，低分子量MRPs组分仍显示出Fe2+螯合活性，并且1～5、5～10 ku组分的螯合活性均显著高于分子量 ＜1 ku的组分（P＜0.05）。这与孙常雁等［23］的研究结果一致，原因可能是低分子量组分中含有肽类物质，而肽能对金属离子有一定程度的螯合作用。

图3 猪骨蛋白酶解液美拉德反应产物的还原能力Fig.3 Reducing power of MRPs derived from PBPH

表1 猪骨蛋白酶解液美拉德反应产物的Fe2+螯合活性Table 1 Fe2+chelating activity of MRPs derived from PBPH

3 结论

本研究表明，猪骨蛋白酶解液与葡萄糖、木糖的美拉德反应产物均呈现出较好的抗氧化活性，2者之间差异不显著；不同分子量范围的反应产物活性表现出一定的差异，分子量＞10 ku组分的DPPH自由基清除率、还原能力以及Fe2+螯合活性均最高，表明高分子量美拉德反应产物具有更强的抗氧化作用。上述研究结果为猪骨蛋白酶解液的美拉德反应产物作为食品抗氧化剂提供了理论依据，对实现畜禽副产物的增值利用具有重要意义。

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（责任编辑 侯春晓）

Study on antioxidative activity of Maillard reaction products derived from porcine bone protein hydrolysates

TANG Hong-gang，XIAO Chao-geng，YE Meng-di，ZHU Pei-pei，CHEN Li-hong*
（Institute of Food Science，Zhejiang Academy of Agricultural Sciences，Hangzhou 310021，China）

Maillard reaction products（MRPs）were prepared by the reaction of porcine bone protein hydrolysates （PBPH）and glucose or xylose.MRPs were isolated to fractions with different molecular weights（＜1，1-5，5-10，＞10 ku）by ultrafiltration.The antioxidative activity of the fractions was determined in vitro，respectively.The results showed that all fractions exhibited antioxidative activity，especially the fractions（MW＞10 ku）had the highest DPPH radical scavenging ability，reducing power and Fe2+chelating activity.It revealed that antioxidative activity of MRPs with high molecular weight were more efficient.The differences of radical scavenging ability，reducing power and Fe2+chelating activity between MRPs derived from glucose and xylose were not significant（P＞0.05），indicating that sugar structure showed no effect on antioxidative activity of MRPs prepared in this study.

porcine bone protein hydrolysates；Maillard reaction products；antioxidative activity

TS251.94

A

1004-1524（2016）08-1396-05

10.3969/j.issn.1004-1524.2016.08.18

2015-12-15

浙江省自然科学基金项目（LY12C20016）

唐宏刚（1980—），男，江苏盐城人，博士，副研究员，主要从事畜产品加工、食品化学研究工作。E-mail：zaastang@163.com
*

，陈黎洪，E-mail：cwc528@163.com