5个绵羊品种CAST基因多态性及其与肉品质的相关性

王 华，王建福，王欣荣，成述儒，李晓梅，王志明，樊庆山，富丽霞，李 双，周晓霞（甘肃农业大学动物科学技术学院，甘肃兰州730070）

5个绵羊品种CAST基因多态性及其与肉品质的相关性

王 华，王建福，王欣荣，成述儒*，李晓梅，王志明，樊庆山，富丽霞，李 双，周晓霞
（甘肃农业大学动物科学技术学院，甘肃兰州730070）

为从分子水平研究甘肃境内典型养殖模式下甘肃高山细毛羊、小尾寒羊、藏羊、蒙古羊和滩羊5个绵羊品种的CAST基因多态性与肉品质的相关性，探讨以CAST为候选基因，提高绵羊肉品质的可能性。采用PCR-SSCP技术对5个绵羊品种的CAST基因内含子3多态性进行检测，并就CAST基因多态性与9月龄肉品质进行相关性分析。根据比对结果发现，与等位基因A相比，等位基因B发现G62T以及C110T突变，等位基因C发现C92T突变，形成AA、AB、BB和AC 4种基因型；经检验表明，5个绵羊品种均处于非Hardy-Weinberg平衡状态；群体遗传多态性分析表明，5个绵羊品种的多态信息含量均为中度多态；关联分析表明，5个绵羊品种CAST基因变异位点的4个基因型间失水率AC基因型显著高于其他基因型（P＜0.05），对于剪切力AC基因型显著低于其他3种基因型（P＜0.05）；不同绵羊品种间基因型分析表明，对于5个绵羊品种AC基因型的失水率显著高于其他3种基因型，除蒙古羊外，AC基因型的剪切力显著低于其他基因型；变异对眼肌面积没有显著性影响。这些关联说明CAST基因可作为候选基因用于绵羊产肉性能和肉品质的分子标记辅助选择。

绵羊；PCR-SSCP；CAST基因；肉质性状；关联性分析

嫩度是对羊肉品质评价的一个重要特征，同时嫩度也是决定肉品质量的主要因素，多年来一直是国内外肉品科学研究的热点之一。影响肉嫩度的因素包括肌节的长度、结缔组织的含量、肌原纤维蛋白的降解程度、畜体的年龄、糖酵解的速度、pH值、可溶性胶原蛋白等。国内外学者对肌原纤维蛋白的降解做了大量研究，发现肉中存在的钙蛋白酶系统对肌肉在成熟过程中的嫩化起一定的调控作用，是肌原纤维蛋白降解的限速步骤［1］，这引起了科研人员的广泛关注。

钙蛋白酶系统在细胞内普遍存在，参与细胞的一系列进程，包括生长、凋亡、迁移和细胞周期等［2］，该系统包括钙蛋白酶（CAPN）、钙蛋白酶抑制蛋白（CAST）和钙蛋白酶激活蛋白（calpain activator），三者相互作用，通过参与肌原纤维蛋白的降解过程影响肌肉生长及嫩化［3］。钙蛋白酶抑制蛋白（CAST）是钙蛋白酶系统的一个重要成员，是细胞内高效、需 Ca2+的内源性专一抑制CAPN活性的蛋白质，它可以识别CAPN与钙结合引起的构象变化并与之特异性结合，通过抑制CAPN的自溶对其进行抑制调节，从而调节肌肉内蛋白的水解速率［4-5］。研究证实，CAST基因是家畜肉质尤其是嫩度性状的候选基因之一。对猪CAST基因的研究发现，不同基因型的肌肉除肌内脂肪和背膘厚差异显著外［6］，其嫩度、屠宰45 min后pH值和滴水损失也存在显著差异［7-8］。对鸡的CAST基因研究表明，鸡的肌纤维密度和直径与CAST基因有显著相关性［9］；对牛的研究也发现，CAST不同基因型与该酶的活性、胴体性状及牛肉剪切值相关［10-11］。燕凤［12］研究绵羊的CAST基因表达量与背最长肌失水率有显著性负相关的结果。本试验利用PCR-SSCP对绵羊CAST基因多态性检测，确定不同基因型效应值与肉品质性状的显著性检验，以期为绵羊肉品质的遗传改良提供依据。

1 材料与方法

1.1 供试动物

选用3月龄甘肃本地5个绵羊品种共250只，静脉采血，均为6 mL·头-1，ACD抗凝，-20℃冻存。9月龄时对各绵羊品种的每个基因型随机选取3只按统一标准进行屠宰，测定肉质品质。

1.2 性状测定

主要测定 pH值（pH value）、失水率（drip loss，DP）剪切力（shear force，SF）、蒸煮损失率（cooking loss rate，CLR）、眼肌面积（Loin muscle area，LMA）。所有性状的测定根据国家标准GB/T17238-1998执行。

1.3 引物设计

参考 GenBank数据库绵羊登录号（FJ843091.1），用primer 5.0对CAST进行引物设计，并由上海生工生物工程有限公司合成。引物序列CAST-up 5-′CTCTTGGACTTTTGAACTGTA-3′，CAST-low 5′-CCACGTGAGTATTCTAAGCA-3′。

1.4 DNA提取及PCR反应体系和程序

采用常规的酚-氯仿抽提法从血样中提取基因组DNA。PCR反应体系为25 μL，模板DNA 1.0 μL（100 μmol·L-1），上、下游引物各1.0 μL （10 μmol·L-1），mixTaq酶12.5 μL（1.25 U），加ddH2O至总反应体系25 μL。扩增程序：94℃ 4 min；94℃30 s，56℃30 s，72℃30 s，35个循环；72℃10 min，4℃保存。

1.5 PCR-SSCP分析

取PCR产物2 μL与8 μL上样缓冲液混匀，然后98℃变性10 min，迅速冰浴5 min，用移液枪将变性样品点于12%非变性聚丙烯酰胺凝胶［m（Acr）∶m（Bis）=39∶1］中，180 V，8℃电泳12 h，硝酸银染色判型。

1.6 数据统计分析

采用SPSS 19.0软件对CAST基因内含子3基因多态性位点在不同绵羊群体中的基因型分布进行分析，配合下列模型进行最小二乘分析，比较各项观察值在CAST基因型之间的差异。

式中：Yijkm为个体某性状表型值，μ为总体均值，Gi为基因型效应，BFj为第j个品种和羊场的合并固定效应，Lk为地区效应，Sm为性别效应，eijkm为随机误差。

2 结果与分析

2.1 PCR产物检测结果

对CAST基因进行扩增，随机选择若干个样品的PCR产物用2%的琼脂糖凝胶电泳检测（图1），结果表明，扩增片段与目的片段（309 bp）大小一致且特异性好，可用于SSCP分析。

2.2 SSCP检测与判型

对CAST基因扩增产物进行SSCP分析发现4种基因型（图2），定义4种基因型为AA、AB、BB和AC。

2.3 CAST基因第3内含子测序结果比对

序列多重比对结果如图3所示。与等位基因A相比，等位基因B在62和110 bp处分别发生了G→T、C→T突变，等位基因C在92 bp处发生了C→T突变。

2.4 CAST基因型频率和基因频率分析

图1 PCR扩增Fig.1 Detection of PCR product

图2 CAST基因扩增序列产物的SSCP检测结果Fig.2 PCR-SSCP analysis of CAST gene

图3 等位基因A、B、C序列比对结果Fig.3 Alignment results of alleles A，B，C sequence

采用群体遗传学方法，分析5个绵羊品种CAST基因变异位点的基因型频率和基因频率。结果表明，甘肃高山细毛羊等位基因A基因频率最高为0.62，蒙古羊最低为0.58（表1）。不同的绵羊群体中等位基因A的频率都在0.5以上，为优势等位基因，等位基因频率为A＞B＞C。5个绵羊品种AA基因型所占比例最多，属于优势基因型。

2.5 CAST基因多态位点的遗传特性

对CAST基因多态性在5个绵羊群体中表现的遗传特性进行统计分析（表2），结果表明，5个绵羊品种的多态信息含量介于0.25～0.50，为中度多态。纯合度都在0.6以上，为高度纯合。5个绵羊品种均偏离哈代温伯格平衡。

2.6 不同基因型与绵羊肉品质的相关性分析

由表3可以看出，变异位点引起的4种基因型，对pH值、蒸煮损失率和眼肌面积没有显著性影响，但AC基因型失水率显著高于其他基因型（P＜0.05），对于剪切力，AC基因型显著低于其他3种基因型（P＜0.05）。

2.7 不同绵羊品种肉品质相关性分析

不同基因型对不同绵羊肉品质相关性分析结果（表4）表明，5个绵羊品种AC基因型的失水率显著高于其他3种基因型（藏羊和滩羊的BB基因型除外）；除蒙古羊外，AC基因型的剪切力显著低于其他基因型。

表1 基因型频率和基因频率Table 1 Genotypic frequency and allelic frequency

表2 五个绵羊品种纯合度、杂合度、有效等位基因数、多态信息含量分析和哈代温伯格平衡Table 2 Analysis of Ho，He，PIC and Hardy-Weiberg in 5 sheep breeds

表3 不同基因型与绵羊肉品质的相关性分析Table 3 Association analysis of sheep meat quality traits in different genotypes

3 讨论

3.1 基因的遗传特性

CAST基因在各个绵羊群体中的PIC均处于中度多态（0.25＜PIC＜0.5），说明甘肃地方绵羊在这个位点的遗传变异较大，这可能与甘肃地方绵羊在杂交选育中的高度选择有关，突变位点均偏离Hardy-Weinberg平衡状态，说明遗传漂变和人工选育等因素对群体造成了很大影响。

表4 不同基因型对不同绵羊品种肉品质的影响Table 4 Effect of different genotypes on meat quality of different sheep varieties

3.2 基因多态性与肉质性状的关系

Calpain基因家族在肉质嫩化上起到了重要的作用［13-14］，而CAST基因作为抑制Calpain的基因，抑制肌原纤维蛋白质的降解［15］，从而影响羊肉嫩化。目前我国肉质标记辅助选择（Markerassistedselection，MAS）的研究多集中于猪，孙立彬等［6］研究了CAST基因多态性与猪肉品质和背膘厚相关性，发现不同基因型与肌内脂肪和背膘厚度之间呈显著相关；吴旧生等［16］研究了金皮猪CAST基因的多态性与肌纤维组织学特性和屠宰性状的相关性，发现 CAST多肽位点不同基因型与肌纤维横截面积和眼肌面积呈显著相关。针对地方绵羊及肉质性状相关候选基因的研究还较局限。CAST基因由于其功能涉及成肌细胞的分化和融合，被认为与家畜肉质尤其是嫩度相关。Smith等［17］的研究证实，CAST基因与肉嫩度和剪切力显著相关，这与 Casas等［18］和 White等［19］的研究结论一致。Bolormaa等［20］利用GWAS技术分析了澳大利亚肉牛的肉质和屠宰性状，在检测到的所有SNP中，包括存在于CAST基因上的突变位点C，A2832G位点的SNP，同样与牛肉嫩度和剪切力呈显著相关。

本研究以甘肃典型养殖模式下养殖数量最多的5个绵羊品种为研究对象对，CAST基因 3内含子部分序列进行多态性分析，并对该位点基因型多态性与多种肉质性状进行差异显著性分析。分析结果表明，5个绵羊品种CAST基因第3内含子区存在丰富的多态性，这些基因多态性与其肉质性状存在一定相关性，本研究发现多态位点引起5个绵羊品种的失水率显著提高，除蒙古羊外，突变引起的剪切力显著低于其他基因型。而本研究中并未发现此处的突变位点对绵羊眼肌面积、pH值存在显著影响，与吴旧生等［16］的结果不一致，以上研究结论的不一致，可能与品种对不同性状影响的差别或数量性状受多基因调控作用影响及研究样本量不够多有关。因此，下一步可扩大样本数量，或筛选其他SNP位点探讨CAST基因多态性与肉质性状之间的相关性。

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（责任编辑 卢福庄）

Association analysis of CAST gene polymorphism with meat quality in five sheep breeds

WANG Hua，WANG Jian-fu，WANG Xin-rong，CHENG Shu-ru*，LI Xiao-mei，WANG Zhi-ming，FAN Qingshan，FU Li-xia，LI Shuang，ZHOU Xiao-xia
（Faculty of Animal Science and Technology，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070，China）

In order to study the relationship between the CAST gene polymorphism and meat quality of 5 sheep breeds （Gansu alpine fine wool sheep，Small tail han sheep，Tibetan，Mongolian sheep and Tan-sheep which were fed in a typical farming mode of Gansu province）in Gansu Province at the molecular level and to explore the possibility of improving the quality of sheep meat by using CAST as a candidate gene，the polymorphism of intron 3 of CAST gene was detected by PCR-SSCP in 5 sheep breeds，and the association between CAST gene polymorphism and meat quality in 9-month-old sheep was analyzed.The results showed：compared with allele A，two mutations were detected which included G62T and C110T in allele B while only C92T was detected in allele C.The mutations formed AA，AB，BB and AC genotypes.Experimental results showed that 5 sheep breeds were in non-Hardy-Weinberg equilibrium state.Population genetic polymorphism analysis showed that the polymorphism information content（PIC）of the 5sheep breeds was moderate.The association analysis showed that the water loss rate of AC genotype was significantly higher than those of others（P＜0.05），the shear forcer of AC was significantly lower than those of other three genotypes（P＜0.05）.Genotype analysis of different sheep breeds showed that the water loss rate of AC genotype was significantly higher than other three genotypes（P＜0.05），and the shear stress of AC genotype was significantly lower than other genotypes（P＜0.05）except Mongolia sheep.The mutation locus had no significant influence on eye muscle area.These associations showed CAST gene could be used as a candidate gene for marker-assisted selection of sheep meat performance and meat quality.

sheep；PCR-SSCP；CAST gene；meat quality traits；association analysis

S826.8

A

1004-1524（2016）08-1309-06

10.3969/j.issn.1004-1524.2016.08.06

2016-01-12

甘肃省农业生物技术研究与应用开发项目（GNSW-2012-26）

王华（1990—），男，山东临沂人，硕士研究生，主要从事动物遗传育种与繁殖研究。E-mail：957777293@qq.com
*

，成述儒，E-mail：chengsr@gsau.edu.cn