橘黄酮的提取及其抑菌特性

赵悦，孙庆元，孙琦（大连工业大学生物工程学院，辽宁 大连 116034）

研究开发

橘黄酮的提取及其抑菌特性

赵悦，孙庆元，孙琦
（大连工业大学生物工程学院，辽宁 大连 116034）

采用乙醇浸提法从橘子皮中提取黄酮，通过正交试验确定提取的最佳条件为：70%乙醇为提取剂，固液比为1︰20（g/mL），提取温度是70℃，提取时间2h，在510nm处测定橘黄酮质量浓度为0.205g/L，从橘子皮中提取的黄酮干重得率为2.938mg/g。本实验探究橘黄酮的抑菌活性，采用牛津杯法测抑菌作用，结果表明，橘黄酮对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、黑曲霉、灰葡萄孢菌和黄枝孢菌均有抑制作用，铜和镁离子可分别增强橘黄酮对细菌和真菌的抑菌作用，低pH和低温可提高抑菌效果，且优化pH和温度的橘黄酮剂型降低了最小抑菌浓度（MIC）20%，对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、黑曲霉、灰葡萄孢菌和黄枝孢菌的抑菌作用分别提高了17%、27%、25%、28%、19%，高于对氯间二甲苯酚和甲基托布津的抑菌作用，特别是高于对细菌的抑菌作用。

浸取；橘皮；黄酮；抑菌；优化；生物技术

柑橘加工产生了大量的柑橘皮渣，占鲜重的40%～50%［1］。柑橘皮渣除含有水分、纤维素、木质素外，还含有丰富的香精油、果胶、色素和类黄酮等生物活性物质，其综合利用价值极高［2］。目前，大多数研究机构对黄酮的研究重点还是在抗氧化性上面［3］，例如对超氧阴离子的去除作用、对羟自由基的清除作用、对抗癌症［4］，还有一些黄酮类化合物的合成［5］，而在抑菌方面的研究少有报道。本研究采用低毒的乙醇浸提法［6-7］，虽然该法比较陈旧，但在本研究中提取率高，且避免使用高污染溶剂，工艺简单，生产成本低，提取纯化过程中乙醇还可以回收利用，节约环保。实验选择最佳的提取方案，并研究橘皮黄酮类化合物抗细菌和真菌的作用，同时考察pH、温度、金属离子对黄酮类化合物抑菌效果的影响。将橘黄酮调节到最佳pH和温度作为优化剂型。橘黄酮是从橘皮中提取的，属天然物质，因此试图将橘黄酮应用于食品的保鲜防腐中［8］，还可作为有机环保温室蔬菜大棚的抑菌剂，既可以使橘皮得到高效利用，又可以抑菌防腐。

1　实验方法

1.1材料和仪器

材料：橘皮、芸香叶苷、蛋白胨、牛肉膏、酵母浸粉、葡萄糖，购自北京奥博星生物有限公司。

菌种：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、黑曲霉，来自大连工业大学生物化学实验室；灰葡萄孢菌和黄枝孢菌，为野外纯化得到。

仪器：722型可见光分光光度计、旋转蒸发器RE-52，上海亚荣；pH计PHS-3C，上海越平。

1.2橘黄酮的提取及含量测定

首先选择乙醇体积分数分别为0、20%、40%，60%、80%提取橘黄酮，获得最佳乙醇体积分数；在最佳乙醇体积分数下，选择橘皮粉末与乙醇溶剂固液比（g/mL）为1︰5、1︰10、1︰15、1︰20、

1︰25取橘黄酮，获得最佳固液比。在最佳乙醇体积分数和固液比下，选择提取温度分别为 40℃、50℃、60℃、70℃、80℃提取橘黄酮，获得最佳温度。在最佳乙醇体积分数、固液比和温度下，选择提取时间分别为1h、2h、3h、4h、5h，获得最佳提取时间。分别测定总黄酮的质量浓度。

根据以上4个因素，采用L9（34）正交实验设计表，以提取的橘黄酮的吸光度值为指标来确定最佳提取条件，将橘皮粉末按最佳提取条件浸提过滤［3］，80℃下旋蒸，所得到的液体即为橘黄酮。

以分析纯芦丁做标准曲线，Y为吸光度，X为芦丁浓度，Y=12.12X - 0.02，R2=0.995，在 8.0～ 48.0mg/L范围内线性关系良好。

式中，ρ为根据标准曲线计算出提取液中黄酮类化合物的质量浓度，mg/L；V为提取液体积；mt为橘皮总质量，g。

1.3橘黄酮抑菌作用的测定

将所得橘黄酮按20%、40%、60%、80%、100%比例进行稀释，分别取橘黄酮稀释液2mL与18mL固体培养基混合，倒入平皿中。再分别吸取1.0×106金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、黑曲霉、灰葡萄孢菌和黄枝孢菌菌悬液 100µL［9］，涂布，培养，测定最小抑菌浓度（MIC）。

向平皿中倒一薄层固体培养基，凝固后放牛津杯，再倒一层固体培养基，凝固后将牛津杯取出，用移液枪吸取菌悬液100µL，涂布平板，再吸取橘黄酮100µL加到小孔中，培养，即为牛津杯法。

将橘黄酮的pH分别调整到3.0、3.5、4.0、4.5、5.0［10］，按牛津杯法培养，分别测定橘黄酮的抑菌圈直径，以对应的pH去离子水为对照。

在最佳抑菌pH下，按牛津杯法将细菌和真菌的分别在29℃、31℃、33℃、35℃、37℃、39℃、41℃和21℃、23℃、25℃、27℃、29℃、31℃、33℃培养，分别测定橘黄酮的抑菌圈直径。

在最佳抑菌pH和温度下，按牛津杯法向每个小孔中分别加入50µL 0.2mol/L的CuSO4、MgSO4、MnSO4溶液，分别测定橘黄酮的抑菌圈直径。

将橘黄酮调节到上述实验得到的最佳温度和pH作为优化剂型。

取2%对氯间二甲苯酚和1%甲基托布津，按牛津杯法，分别测定这两种抑菌剂的抑菌圈直径。

实验均设3次重复。

2　结果与讨论

2.1影响橘黄酮提取因素的分析

根据1.2节的实验步骤获得各因素与橘黄酮提取量的关系，结果见图1。由图1（a）可见，随乙醇体积分数的增高，橘黄酮的提取量也增高，在乙醇体积分数为60%时，橘黄酮质量浓度为最高 0.164 g/L，在乙醇体积分数为80%时，橘黄酮质量浓度有所降低，可能是由于随着乙醇含量增高，浸出的物质也更多。由图1（b）可见，随固液比增高，橘黄酮提取量也增高，当固液比为 1∶15（g/mL）时，橘黄酮提取量达到最高0.170g/L，固液比再增加，橘黄酮的提取量却有所下降。由图1（c）可见，随温度升高，橘黄酮提取量增高，在50～70℃之间并无太大差异，在60℃时橘黄酮质量浓度为最高0.177g/L，随后下降。由图1（d）可见，随时间增加，提取的橘黄酮浓度增高，长时间的浸提可以让橘黄酮更好的浸出，当4h时，橘黄酮质量浓度为最高0.181g/L，而当5h时，已经无法浸出更多活性物质。

图1　不同因素对橘黄酮提取效果的影响

2.2橘黄酮的最佳提取因素的分析

表1为影响橘黄酮因素的正交实验结果及极差分析。A、B、C、D分别表示乙醇体积分数、固液比、温度、时间。通过极差分析可得，各因素对提取率影响的主次因素为A＞B＞C，C与D的影响主次相同，优方案为A3B3C3D2。最终确定橘黄酮提取的最佳条件为：70%乙醇为提取剂，固液比为1︰20（g/mL），提取温度是70℃，提取时间2h。橘黄酮质量浓度为0.205g/L，得率为2.938mg/g。乙醇回收率可达94.05%。

表1　影响橘黄酮因素的正交实验结果及极差分析

2.3橘黄酮抑菌作用的分析

按1.3节的实验步骤分析橘黄酮的抑菌作用，结果如图 2～图 4。从图 2可以看出，橘黄酮在pH较低时，抑制细菌和真菌的作用较低，当橘黄酮在pH为3.5～4时，抑制金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的作用最强，抑制黑曲霉、灰葡萄孢菌和黄枝孢菌的作用最强。随着 pH增加，抑制细菌的作用开始减弱。这可能是由于细菌的细胞壁大多是由肽聚糖构成，而丝状真菌的细胞壁中几丁质含量很高，细菌和有丝真菌中细胞壁构成的主要成分对pH的耐受性不同，导致了最适抑菌pH不同［11］。

从图3可以看出，橘黄酮抑制细菌（金黄色葡萄球菌和大肠杆菌）的最佳温度为31～33℃，抑制真菌（黑曲霉、灰葡萄孢菌和黄枝孢菌）的最佳温度为27～29℃。

图2　不同值对橘黄酮抑菌作用的影响

图3　不同温度对橘黄酮抑菌作用的影响

从图4看出，橘黄酮加入了金属离子后，金属离子不同程度地提高了橘黄酮的抑菌作用。其中铜离子提高橘黄酮的抑菌作用最大，与镁离子相比提高了143%～216%，与锰离子相比提高了49%～133%。对于丝状真菌来说，锰离子提高橘黄酮的抑菌作用比镁离子的大，对黑曲霉、灰葡萄孢菌、黄枝孢菌分别提高了119%、95%、112%。

图4　不同离子对橘黄酮抑菌作用的影响

2.4优化剂型橘黄酮的抑菌作用的分析

根据上述实验可以得出橘黄酮的最佳抑菌 pH 为3.5～4，最佳抑菌温度为27～29℃。将橘黄酮调整到最佳抑菌pH和最佳抑菌温度下，作为优化剂型测试橘黄酮对5种细菌的抑菌作用，以橘黄酮最初提取出来的初始pH和初始温度作为对照。结果见图5～图7。

从图5可以看出，除了对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度未发现降低外，优化剂型的橘黄酮比对照组的最低抑菌浓度都有所降低。 优化剂型的橘黄酮对大肠杆菌、黑曲霉、灰葡萄孢菌和黄枝孢菌的最低抑菌浓度均下降了20%。

橘黄酮对细菌与真菌均有抑菌作用，对细菌的抑菌作用强于对丝状真菌的抑菌作用，这可能与细胞壁的结构构成不同有关［11］。

图5　优化剂型的橘黄酮最低抑菌浓度的分析

图6　橘黄酮优化剂型的抑菌能力分析

图6是橘黄酮优化剂型的抑菌能力分析。从图6看出，优化剂型的橘黄酮的抑菌能力比对照组的也提高了，对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、黑曲霉、灰葡萄孢菌、黄枝孢菌分别提高了17%、27%、25%、28%、19%。

图7　橘黄酮与其他杀菌剂的抑菌能力对比分析

图7是橘黄酮与其他杀菌剂的抑菌能力对比分析。从图7可以看出，与对氯间二甲苯酚相比，优化剂型橘黄酮对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、黑曲霉、灰葡萄孢菌、黄枝孢菌的抑菌作用分别提高了24%、57%、19%、11%、4%；与甲基托布津相比，对这些菌的抑菌作用分别提高了41%、105%、29%、9%、6%。

3　结　论

乙醇浸提法从橘子皮中提取黄酮类化合物的最佳条件为：乙醇体积分数70%，固液比1︰20（g/mL），温度70℃，浸提时间2h，在510nm下测得所提取的提取液中黄酮含量为 0.205g/L，得率为2.938mg/g，乙醇回收率可达 94.05%。本研究提取的橘黄酮对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、黑曲霉、灰葡萄孢菌、黄枝孢菌均有抑菌作用，对细菌的抑菌作用强于丝状真菌，橘黄酮抑菌作用与其本身浓度成正比。在低pH和低温情况下，橘黄酮抑菌作用强，优化pH和温度的橘黄酮剂型降低了最小抑菌浓度（MIC），除金黄色葡萄球菌以外，对大肠杆菌、黑曲霉、灰葡萄孢菌、黄枝孢菌的MIC均降低20%。与铜离子相协同，抑菌作用得到很大提升。本研究所提取的橘黄酮的抑菌作用高于同类杀菌剂对氯间二甲苯酚和甲基托布津，尤其是对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌。

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Extraction of flavonoids from Citrus reticulate and their antimicrobial characteristics

ZHAO Yue，SUN Qingyuan，SUN Qi
（School of Biological Engineering，Dalian Polytechnic University，Dalian 116034，Liaoning，China）

The flavone compounds were extracted from citruspeels with a modified ethanol extraction method. The optimum extraction conditions were determined by orthogonal tests as：70% ethanol as extractant with solid to liquid ratio 1︰20（g/mL） at 70℃ for 2 hours. The concentration of the flavone compounds were determined with a spectrophotometer at λ=510nm. The results showed that the yield of flavone compounds to the raw materials reached 2.938mg/g，and the ethanol recovery could be up to 94%. The antimicrobial features were also studied. The inhibition of the extracted flavonoids against the growth of Staphylococcus aureus，E. coli，Botrytis cinere，and Cladosporiumfulvum was found，and copper and magnesium ions could enhance the inhibition function on bacteria and fungus respectively. In addition，pH and temperature of the flavonoids could affect the inhibition efficiency. The minimum inhibition concentration（MIC）was reduced by 20% with the ideal formulation of the extracted flavonoids，and the inhibition capabilities against Staphylococcus aureus，E. coli，Aspergillus niger，Botrytis cinere，and Cladosporiumfulvum were increased by 17%，27%，25%，28%，19% respectively under acidic pH and suitable temperature. The inhibition capabilities of the extracted flavonoids against bacteria and fungus，particularly against bacteria，were higher than those of chloro 3，5-dimethylphenol p-chloro-m-xylenol and thiophanate-methyl at the equivalent concentration.

leaching；citruspeel；flavone；inhibition；optimization；biotechnology

Q 936

A

1000-6613（2016）08-2528-05

10.16085/j.issn.1000-6613.2016.08.35

2015-12-07；修改稿日期：2016-01-14。

赵悦（1990—），女，硕士研究生。联系人：孙庆元，教授。E-mail qsun@dlpu.edu.cn。