DEC1基因表达对人食管癌ECA109细胞增殖及侵袭能力的影响

邱娟　张世坤

(焦煤集团中央医院 检验科　河南 焦作　454000)



DEC1基因表达对人食管癌ECA109细胞增殖及侵袭能力的影响

邱娟张世坤

(焦煤集团中央医院 检验科河南 焦作454000)

目的分析DEC1基因表达水平在对人食管癌ECA109细胞增殖和侵袭能力的影响，并探讨其可能机制。方法取人食管癌ECA109细胞，分别将质粒pcDNA3.1(-)/DEC1(研究组)和pcDNA3.1(-)(对照组)转染至该细胞并获得重组细胞。Western blot 技术对细胞周期蛋白cyclin D1、基质金属蛋白酶9(MMP9)以及DEC1蛋白表达进行检测；采用Transwell实验、平板集落实验以及CCK-8实验对细胞增殖和侵袭能力进行检测。结果研究组细胞DEC1蛋白表达水平高于对照组(P<0.05)，而cyclin D1、MMP9表达低于对照组(P<0.05)。研究组细胞增殖和侵袭能力低于对照组(P<0.05)。结论DEC1表达水平可对人食管癌ECA109细胞增殖和侵袭能力造成一定影响；抑制cyclin D1和MMP9表达可能为其作用机制。

食管癌；DEC1基因；ECA109细胞；增殖；侵袭

食管癌是我国最常见的恶性肿瘤之一。即便近年来关于食管癌的早期诊断与临床干预技术获得了较大进步，但其发病率与病死率仍居高不下[1-2]。因此，探讨食管癌新的治疗方案具有重要意义。多种基因可调控食管癌的发生发展[3-4]，其中分化型胚胎软骨发育基因1(DEC1)参与机体神经、软骨以及其他细胞的形成与分化，并在肿瘤细胞的增殖与分化中具有一定作用。本研究对DEC1基因在食管癌ECA109细胞中的作用进行研究，探讨其对肿瘤细胞增殖与侵袭能力的影响。

1　资料与方法

1.1实验材料及条件人食管癌ECA109细胞购自河南省肿瘤医院实验室；兔抗人DEC1单克隆抗体购自上海汉恒生物科技公司；兔抗人cyclin D1 和MMP9单克隆抗体以及HRP标记的羊抗兔IgG均购自南京建成生物技术研究所；actin抗体购自Santa Cruz；脂质体转染试剂购自上海壹研生物科技公司；Total RNA提取试剂盒购自上海吉凯基因化学技术有限公司。全部实验在焦煤集团中央医院中心实验室完成。

1.2检测方法

1.2.1质粒的构建与转染根据DEC1基因cDNA序列设计引物，引物合成由南京建成生物技术研究所制备。取人食管癌ECA109细胞，提取总RNA并反转录获得cDNA，PCR扩增。严格依据上海吉凯基因化学技术有限公司说明书构建pcDNA3.1(-)/DEC1和pcDNA3.1(-)重组质粒，并分别令其为研究组和对照组。按照脂质体操作说明将其转染至ECA109细胞。

1.2.2蛋白表达水平检测转染72 h后，提取两组食管癌ECA109细胞总蛋白并测定浓度，加入缓冲液，80 V恒压SDS-PAGE，250 mA恒流2 h后转至PVDF膜，室温下脱脂牛奶封闭2 h。4 ℃环境下与特异性一抗结合12 h，二抗孵育2 h，采用ECL化学发光并显影，根据显影结果定量检测DEC1蛋白的表达水平。

1.2.3细胞增殖及侵袭能力检测分别采取Transwell实验、平板集落实验以及CCK-8实验对细胞增殖和侵袭能力进行检测。①Transwell实验：将血清BRMI 1640培养基稀释、混匀，分别取60 μl置于Transwell小室，37 ℃孵育2 h。取细胞悬液100 μl加入上室中，取15%胎牛血清培养基加入下室，于5% CO2培养箱中，在37 ℃环境下孵育24 h。擦掉上室细胞，以PBS缓冲液洗3次，甲醇固定30 min，结晶紫染色10 min。PBS缓冲液洗净，常温下风干。光镜下随机选取3个视野进行细胞计数。②平板集落实验：收集转染24 h的各组细胞，接种于6孔板，每孔1 000个，于5% CO2培养箱中在37 ℃环境下培养，2～3 d换液，10 d后固定并结晶紫染色。③CCK-8实验：收集转染24 h的各组细胞接种于96孔板中，每孔2 000个。在细胞贴壁后计时。分别于1、24、48、72、96 h加入10 μl CCK-8液，37 ℃环境下孵育2 h，测定吸光度，波长450 nm。

2　结果

2.1蛋白表达水平研究组cyclin D1、MMP9以及DEC1蛋白表达水平分别为(1.14±0.04)kD、(0.62±0.02)kD和(0.24±0.01)kD，对照组则分别为(0.01±0.00)kD、(0.97±0.04)kD和(0.46±0.02)kD。研究组细胞DEC1蛋白表达水平高于对照组(P<0.05)，cyclin D1、MMP9表达水平低于对照组(P<0.05)。

2.2细胞生长与克隆能力平板集落实验显示，研究组细胞克隆团数量为(54.36±8.72)个，CCK-8实验显示其细胞生长速度较低；对照组细胞克隆团数量为(225.37±12.64)个，CCK-8实验显示其细胞生长速度较低。研究组细胞增殖能力低于对照组(P<0.05)。见图1。

图1　过表达DEC1基因对ECA109细胞克隆形成能力的影响

2.3细胞侵袭能力Transwell实验显示，研究组穿过基底膜的细胞数为(12.41±3.79)个，而对照组为(58.37±5.24)个。研究组细胞侵袭能力低于对照组(P<0.05)。见图2。

图2　过表达DEC1基因对ECA109细胞侵袭能力的影响

3　结论

尽管目前对食管癌已经采取外科手术、放疗及化疗等综合方式治疗，但患者病死率仍处于较高水平，预后不佳[5]。分子靶向治疗是近年来的研究热点，可通过调节相关基因表达水平对恶性肿瘤细胞进行抑制或促使其凋亡，并可完全避免常规治疗所引起的毒副作用[6-7]，因此具有广阔前景。

DEC1基因是DEC家族中的一种，该基因参与机体多种组织细胞的分化活动，在神经发育、软骨形成以及其他细胞的形成与分化中具有重要作用，并在肿瘤细胞的增殖与分化中具有一定作用。近年来，已在食管癌、肺癌及乳腺癌等多种肿瘤细胞中检测到DEC1基因高表达，提示该基因表达水平可能与肿瘤的发生发展具有一定关系。

cyclin D1和MMP9是调控恶性肿瘤细胞增殖的重要因子，并增强肿瘤细胞的侵袭能力。本研究通过构建重组细胞，并通过检测上述蛋白的表达水平及肿瘤细胞的增殖与侵袭能力，进行对比分析。结果显示，与对照组比较，在pcDNA3.1(-)/DEC1转染的细胞中，DEC1蛋白高表达，而cyclin D1和MMP9低表达。在对细胞的增殖和侵袭能力进行分析后进一步发现，pcDNA3.1(-)/DEC1转染的细胞生长速度和克隆能力显著下降，穿过基底膜的细胞数减少。上述结果表明，DEC1蛋白高表达可抑制食管癌细胞的增殖和侵袭能力，而作用机制可能为通过抑制cyclin D1和MMP9表达能力而达到上述作用。

综上，通过本研究我们认为，DEC1基因表达水平对调节食管癌ECA109细胞增殖和侵袭能力具有一定作用。但能否将DEC1基因作为肿瘤标志物并靶向调控肿瘤细胞生长与凋亡尚需进一步研究，而本研究为食管癌的靶向治疗提供了一定的参考价值。

[1]周荣秒,李宾,牛朝旭,等.shRNA干扰PLCε1基因对人食管癌Eca109细胞增殖和细胞周期的影响[J].基础医学与临床,2015,35(2):208-212.

[2]樊建军,武家艳,李海玉,等.RNAI沉默Grp94基因对人食管癌ECA109细胞迁移及侵袭能力的影响[J].第三军医大学学报,2015,37(12):1222-1225.

[3]尹素改,王慧慧,陈玉龙,等.启膈散乙酸乙酯部位抑制食管癌Eca109细胞STAT3信号通路诱导细胞凋亡的研究[J].广州中医药大学学报,2015,32(5):857-860.

[4]王昆仑,徐晓霞,张忠献,等.DNA-PKcs蛋白在食管癌组织中的表达及临床病理相关性研究[J].河南医学研究,2014,23(12):1-3.

[5]王华川,温剑虎.siRNA介导的nestin基因沉默对人食管癌ECA109细胞侵袭和迁移的影响及机制[J].中国病理生理杂志,2015,31(8):1432-1436.

[6]尹素改,王慧慧,吴耀松,等.六君子汤提取物对食管癌Eca109细胞的增殖抑制作用[J].中国实验方剂学杂志,2015,21(1): 163-166.

[7]康强强,唐敏,侯妍利,等.两性霉素B通过调节HIF-1α活性抑制缺氧环境下食管癌Eca109细胞的侵袭迁移能力[J].南方医科大学学报,2015,34(6):798-801.

Effect ofDEC1 gene expression on proliferation and invasion abilities of human esophageal cancer ECA109 cells

Qiu Juan, Zhang Shikun

(DepartmentofClinicalLaboratory,JiaozuoCoalIndustryGroup,Jiaozuo454000,China)

ObjectiveTo investigate the effect ofDEC1 gene expression on proliferation and invasion abilities of human esophageal cancer ECA109 cells. MethodsHuman esophageal cancer ECA109 cells were selected and transfected with plasmid pc DNA3.1(-)/DEC1 (study group) and pcDNA3.1(-) (control group). The expression of DEC1 mRNA was evaluated by real-time PCR, and the protein of cyclin D1, MMP9 and DEC1 were evaluated by Western blot. The cell proliferation and invasion ability were evaluated by Transwell test, colony formation assay and CCK-8 assay. ResultsThe expression levels of DEC1 mRNA and DEC1 in the study group were significantly higher than those in the control group(P<0.05), but the expression levels of cyclin D1 and MMP9 were significantly lower than that of the control group(P<0.05). The cell proliferation and invasion ability of the study group was lower than that of the control group(P<0.05). ConclusionThe expression level of DEC1 may affect the proliferation and invasion of human esophageal cancer ECA109 cells, and the inhibition of cyclin D1 and MMP9 expression may be the mechanism of its action.

esophageal cancer;DEC1 gene; ECA109 cells； proliferation; invasion

R 735.1

10.3969/j.issn.1004-437X.2016.07.003

2016-02-29)