二氧化碳气腹对大鼠肝脏造成的缺血再灌注损伤及异丙酚促进HO-1表达的保护作用

邹海波，杨　竹，王　颖，孙晓峰



二氧化碳气腹对大鼠肝脏造成的缺血再灌注损伤及异丙酚促进HO-1表达的保护作用

邹海波，杨竹，王颖，孙晓峰*

沈阳医学院附属中心医院麻醉科，沈阳 110000

[摘要]目的探讨实验室二氧化碳(CO2)模拟腹腔镜高气腹压力对大鼠肝脏造成的缺血再灌注损伤以及异丙酚的保护作用和机制。方法选用280～320 g的Wistar成年雄性大鼠，实验前各组大鼠禁食12 h，可自由饮水。选取雄性大鼠48只，随机分成4组，每组12只：对照组(A组)、缺血组(B组)、再灌注组(C组)、异丙酚组(D组)，观察各组天冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)以及血红素氧合酶1(HO-1)表达的变化。结果B组、C组与A组比较，MDA逐渐增高，而SOD逐渐降低，HO-1表达反应性逐渐增加，HE染色和免疫组化提示损伤逐渐加重；D组与B组、C组比较，MDA指标明显降低，SOD明显增高，HO-1表达继续增加，HE染色和免疫组化可见损伤明显减轻。结论CO2气腹可以造成大鼠肝脏缺血再灌注损伤；缺血和再灌注是不同的损伤过程，即：缺血状态解除后，对大鼠肝脏损伤并未停止，反而由于再灌注过程而进一步加重；异丙酚可通过促进HO-1的表达机制而发挥其保护性作用。

[关键词]二氧化碳；缺血再灌注损伤；肝脏；异丙酚；血红素氧合酶1

0　引言

在外科领域，随着人们对微创理念的认可，腹腔镜手术脱颖而出，凭借其微创、美观、术后恢复快等诸多优点而倍受医生和患者的喜爱，因此在临床外科手术中的应用越来越广泛，但CO2高气腹压对腹腔脏器带来的诸多不良影响也日渐引起了世人的关注。异丙酚作为一种临床麻醉常用药，具有抗氧化应激作用，它对肝脏缺血再灌注损伤的保护作用及其机制目前还存在争议。本实验以Wistar大鼠肝脏为实验靶点，观察气腹前后各个功能指标的变化，从而探讨二氧化碳气腹对大鼠肝脏造成的缺血再灌注损伤及异丙酚促进HO-1表达的保护作用。

1　材料与方法

1.1动物分组及动物模型模型：实验前禁食12 h，自由饮水，实验时将大鼠固定，经大鼠腹腔给予10%水合氯醛(3 mL/kg)进行麻醉，腹部插入气腹针，气腹压力设置20 mmHg，颈动脉剖开插管待抽血。分组：选用成年Wistar雄性大鼠48只，体重280～320 g，随机分成4组，每组12只。A组(对照组)：经尾静脉穿刺置管，泵注生理盐水1 h[10 mL/(kg·h)];B组(缺血组)：在A组基础上给予20 mmHg气腹压力1 h;C组(再灌注组)：在B组的基础上，放开气腹0.5 h;D组(异丙酚组)：经尾静脉泵注异丙酚(购于阿斯利康AstraZeneca公司，批号CD495)10 mg/(kg·h)(用生理盐水进行10倍稀释)，同时给予20 mmHg气腹压1h后放开气腹后0.5 h。

1.2待检指标超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(Malondialdehyde，MDA)：取肝脏组织液氮中冷冻,待检MDA(硫代巴比妥酸比色法测定，试剂盒：购于南京建成生物工程研究所)和SOD(试剂盒：购于南京建成生物工程研究所，黄嘌呤氧化酶法测定)；应用HE染色肺脏组织学变化；应用免疫组化检测HO-1的表达；应用Realtime PCR检测HO-1 mRNA；应用Western印迹检测肝组织HO-1表达(兔抗大鼠HO-1多克隆抗体：购于北京博奥森生物技术有限公司；二氨基联苯胺显色试剂盒：购于武汉博士德公司；链霉亲合素-生物素复合物免疫组化试剂盒：购于武汉博士德公司)。

2　结果

2.1生化指标实验分为4组，每组大鼠12只，大鼠肝缺血再灌注损伤时组织中SOD、MDA、ALT、AST的变化见表1。

表1　大鼠肝缺血再灌注损伤时组织中SOD、MDA、ALT、AST的变化结果(n=12)

注：*与A组相比，P<0.05；，+与B组相比，P<0.05；#与C组相比，P<0.05

2.2HE染色缺血组图片中，可见肝细胞出现了大量变性，甚至偶可见到坏死的肝细胞；再灌注组图片中，可见肝细胞坏死数量明显增多，证明再灌注后损伤明显加重；异丙酚组图片中，肝细胞变性和死亡的数量减少，损伤程度明显减轻。见图1。

图1　肝HE染色

2.3免疫组化对照组中，HO-1蛋白表达较少，但在缺血组可以看到HO-1表达明显增多，再灌注发生后HO-1表达持续增加，特别是在异丙酚组，HO-1蛋白密集排列并发生“聚集现象”，表明这是I/R发生以后，异丙酚促使HO-1表达量增加所致。见图2。

图2　肝免疫组化

2.4Realtime PCR检测HO-1mRNA在应激状态下可以表达一种保护性蛋白HO-1，在A组、B组、C组、D组中的表达逐渐增高(B组、C组与A 组间比较，差异有统计学意义，P<0.05；D组和C组间比较，差异有统计学意义，P<0.01)，见图3。

图3　Realtime PCR检测HO-1 mRNA的表达

2.5Western印迹检测与A组比较，B组、C组中HO-1蛋白表达水平逐渐升高；D组HO-1表达水平明显高于B组和C组。见图4。

图4　Western印迹检测结果

3　讨论

肝脏缺血再灌注损伤(I/R)是手术中比较常见的病理生理过程，多见于肝脏血流受阻断的肝脏外科手术[1]，非阻断肝血流的手术(如：腹腔镜胆囊切除)也可以对肝脏造成缺血再灌注性损伤，因此已经引起临床外科和麻醉医生的重视。肝脏是一个对缺血缺氧极为敏感的器官，一旦血流被阻断，肝细胞内的能量很快消耗殆尽，并由于能量不足引起结构和功能损害。这种损伤不仅发生在缺血时，恢复血流后，损伤不但不会减轻，反而还会继续加重，即缺血再灌注损伤[2]。Kupffer细胞激活释放大量氧自由基和炎性介质，被认为是缺血再灌注早期最主要的损伤机制[3]。从分子水平层面，肝脏I/R具有十分复杂的分子机制，诸多分子通道与炎症因子产物相互反馈，产生一系列的级联效应,导致肝组织的严重损伤[4]。在正常生理状态，自由基的清除与生成处于动态平衡中，但在某些病理状态下(如肝脏再灌注损伤)时，组织通过“呼吸爆发”、吞噬细胞系统、儿茶酚胺的自身氧化途径等产生大量氧自由基(OFR)。OFR是缺血器官再灌注后致组织损伤最早、最重要的有害物质之一[5]。大量氧自由基可激活NF-κB，促使炎症因子释放大大增加[6]。

MDA是发生过氧化反应(LP)过程中，细胞膜内所含的不饱和脂肪酸受到氧自由基攻击后所产生的毒性过氧化产物(LPO)。虽然大量LPO产生，但其性质极不稳定，直接测定其在肝脏组织中的含量极为困难。而MDA作为LP过程的终末代谢产物，其性质比较稳定。测定MDA含量可间接反映肝脏组织内LP的过氧化程度，进而间接反映肝脏缺血再灌注损伤的程度，同时也间接反映细胞损伤的程度[7]。 SOD是体内最主要的自由基清除剂。正常生理状态时，SOD与过氧化氢发生反应，再由过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶转变为水，从而使自由基清除；但在I/R过程中，“氧化-抗氧化”的平衡状态被打破，过氧化反应呈病理性增强，自由基可以与细胞膜磷脂等重要功能性单位发生反应，使其失去正常的生理功能。因此，SOD在I/R发生过程中的含量变化可以很敏感地反映肝脏组织的损伤程度。

HO-1又称热休克蛋白32(Hsp32)，是一种限速酶，正常生理情况下可存在于多个脏器与组织中，表达量较少。但在应激情况下，HO-1的表达便会反应性地增强，以减少应激状态带来的损伤[8]。有研究表明，HO-1可通过催化血红素生成一氧化碳(CO)、铁离子和胆绿素的机制，在肝脏缺血再灌注方面发挥重要作用；HO-1可以减轻自由基对细胞膜所引发的过氧化反应，下调半胱氨酸蛋白酶活性，以对抗细胞凋亡和肿瘤坏死因子(TNF)水平。在本实验中，通过免疫组化、Realtime PCR检测和Western印迹检测的方式，多层面地证明HO-1在A组、B组、C组、D组中的表达逐渐增高，以D组最为明显，也充分证明了异丙酚在大鼠肝脏缺血再灌注损伤过程中，可以通过诱导HO-1的表达而发挥对肝脏的保护性作用。 异丙酚是一种较有效的酚类抗氧化剂，可以与氧自由基结合生成稳定的酚氧自由基[9]，在高气腹压所致I/R时，异丙酚可以明显降低氧自由基水平，其主要保护性作用的机制如下：异丙酚可以直接与自由基发生反应，减轻细胞膜的过氧化反应，稳定细胞膜；上调肝脏组织内SOD的活性，间接减轻I/R的损伤程度；在I/R过程中，减轻中性粒细胞浸润和胶质细胞炎性因子的释放[10];增加NO的含量，改善微循环障碍；脂溶性高，很容易进入细胞的脂质双分子层并在局部聚集，从而提高细胞抗氧化损伤的能力。此外，异丙酚能够抑制I/R后TNFα-mRNA 和蛋白表达，发挥其保护作用[11]。目前认为，TNF-α和IL-1β在I/R中起初始激发作用[12]。本次实验结果表明，异丙酚还具有另外一个保护机制：其可以在肝脏I/R过程中，促进HO-1的蛋白的表达，从而间接发挥保护性作用。

综上所述，CO2气腹对大鼠肝脏可以造成缺血性损伤，但气腹压力解除后损伤并没有停止，反而继续加重，其原因为再灌注时，大量代谢产物、氧自由基等释放入血进入全身循环，进一步加重再灌注肝组织的损伤[13]。另外，肝脏发生I/R后，细胞凋亡是肝细胞死亡的主要方式[14]。除了肝自身的损伤以外，还会造成其他远隔器官损伤[15]。异丙酚可以通过增加HO-1蛋白的表达机制减轻大鼠肝脏I/R的损伤。

参考文献：

[1]杨禄坤，周少朋，林宇静.缺血预处理对大鼠肝缺血再灌注肾损伤的影响[J].中山大学学报(医学科学版),2012，6(33)：761-765.

[2]凌云志，禹莉，梁启胜,等.七氟醚对兔肝脏缺血再灌注损伤的影响[J].蚌埠医学院学报,2012,8(37)：884-895.

[3]蔡俊赢，徐国海.乙酰半胱氨酸对兔肝缺血再灌注损伤的保护机制探讨[J].免疫学杂志,2013，29(1)：53-55.

[4]慕宁,江艺,吕立志.落新妇甙对缺血再灌注损伤肝脏HO-1表达的影响[J] .世界华人消化杂志,2013，21(35):4019-4023.

[5]谭金峰，王现雷，金哲浩,等.肝缺血再灌注损伤机制与防治的最新认识[J] .疑难病杂志,2013，12(12)：75-77.

[6]卢建喜，杨涛 .亚甲蓝预处理对大鼠肝缺血再灌注肺损伤的保护作用[J].浙江创伤外科,2012,2(17)：37-40.

[7]张华，吴丛月，王波.止血带诱发肢体缺血再灌注损伤不同指标的临床观察[J].全科医学临床与教育,2013，2(11)：145-147.

[8]张殷，高伟忠，但伶.丙泊酚对大鼠肝缺血再灌注致急性肺损伤时Nrf2和HO-1表达的影响[J].中国老年学杂志,2013,(33)：3126-3128.

[9]苏丽东，莫日根，丰波.丙泊酚对大鼠缺血再灌注致肝损伤保护作用的实验研究[J].内蒙古大学生命科学学院，2014，33(3)：123.

[10]李肇端，王准，吕丹,等.右美托咪啶联合异丙酚预处理对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的影响[J].山东医药,2014，54(4):25-27.

[11]王红杰，张建新，解丽君,等 异丙酚对糖尿病大鼠缺血再灌注心肌NF-κB、TNF-α和IL-6的影响[J].河北医药,2013,24(35):3685-3688.

[12]王永光，李养军，高小鹏.RvE1对肝缺血再灌注损伤大鼠库普弗细胞中Chemerin表达的影响[J] .陕西医学杂志,2012，2(41):133-135.

[13]徐向辉，张锦枝，张冬梅.舒芬太尼对止血带引起肢体缺血再灌注损伤的影响[J] .中国实用医药,2012,22(7)：12-14.

[14]朱宇麟，李静，吕毅,等.缺血后处理对肝缺血再灌注损伤后磷脂酰肌醇-3激酶和细胞外信号调节激酶的影响和意义[J].南方医科大学学报,2012,32(5):677-680.

[15]周权明，刘俊，章加宽.灯盏花素对大鼠肝缺血再灌注后肺损伤的保护作用 [J].吉林医药学院学报,2012,33(2):71-73.

收稿日期：2015-09-10

*通信作者

DOI:10.14053/j.cnki.ppcr.201603007

Hepatic ischemic reperfusion injury caused by experimental simulated laparoscopic high CO2pneumoperitoneum pressure and the protective effect and mechanism of propofol in rats

ZOU Hai-bo,YANG Zhu,WANG Ying,SUN Xiao-feng*

(Desect1ment of Anesthesiology,the Center Hospital Affiliated to Medical School of Shenyang,Shenyang 110000,China)

【Abstract】ObjectiveTo investigate the hepatic ischemic reperfusion injury (IRI) caused by experimental simulated laparoscopic high CO2 pneumoperitoneum pressure and the protective effect and mechanism of propofol in rats.Methods48 Wistar rats (280～320 g) were selected and prepared by fasting but freely drinking for 12 hours before the following experiments.The selected rats were randomly divided into the following 4 groups (12 in each):control-group (group A),ischemic-group (group B),reperfusion-group (group C) and propofol-group (group D).The expression changes of AST,ALT,SOD,MDA and HO-1 were detected individually.ResultsCompared with group A,higher expression of MDA but lower SOD and reactive gradual increase of HO-1 were shown in group B and group C,and the results of hematoxylin-eosin staining and immunohistochemistry indicated an gradually aggravated injury.Compared with group B and group C,an obviously decreased MDA but increased SOD and HO-1 expression were shown in group D,meanwhile,the results of hematoxylin-eosin staining and immunohistochemistry revealed an alleviative injury.ConclusionCO2 pneumoperitoneum can cause the hepatic ischemic reperfusion injury in rats; The ischemia and reperfusion are two steps of different damages process.The liver damages do not stop but aggravate in reperfusion process though the ischemic state was removed; Propfol has a protective effect through the mechanism of promoting HO-1 expression.

Key words：Carbon dioxide;Ischemic/reperfusion injury;Liver;Propfolum;HO-1