甘草酸二铵对大鼠肝微粒体细胞色素P450酶含量及活性的影响

张瑛瑛



甘草酸二铵对大鼠肝微粒体细胞色素P450酶含量及活性的影响

张瑛瑛

辽宁中医药大学附属医院药剂科，沈阳 110032

[摘要]目的研究甘草酸二铵对大鼠肝微粒体的蛋白含量、CYP450酶总量和CYP2C6、CYP2C11、CYP2D2活性的影响。方法Wistar大鼠灌胃给予甘草酸二铵[50 mg/(kg·d)]，连续7 d，测定其肝微粒体蛋白含量、CYP450蛋白含量以及CYP2C6、CYP2C11和CYP2D2活性。结果与对照组比较，甘草酸二铵给药组大鼠肝微粒体蛋白含量及肝微粒体CYP450含量差异无统计学意义(P>0.05)，CYP2C6、CYP2C11酶的活性差异有统计学意义(P<0.05)，CYP2D2酶活性差异无统计学意义(P>0.05)。结论甘草酸二铵可以抑制CYP2C6、CYP2C11酶的活性。

[关键词]甘草酸二铵；CYP450；CYP2C6；CYP2C11；CYP2D2

0　引言

甘草酸二铵是甘草有效成分的第三代提取物，具有抗炎、抗过敏、免疫调节、保护肝细胞、改善肝脏功能及抗癌等作用，临床上主要用于各类病毒性肝炎以及肿瘤化疗和肾移植术后的肝功能异常的治疗[1-2]。口服给药后甘草酸二铵经胃酸水解，在链霉菌和肝中葡糖醛酸酶的作用下转化为甘草次酸，并由甘草次酸发挥药物的生物活性作用[3-4]。目前随着中草药使用的增加，草药-药物相互作用的报道也逐渐增多，其中多数显著的草药-药物相互作用都是由草药介导的对CYP450酶的调节作用引起的[5]。因此，阐明草药有效成分对CYP450酶的影响对保证草药-西药临床联合用药的安全性具有重要意义。甘草作为一种广泛使用的草药，其有效成分甘草酸已被证明对大鼠CYP3A4、CYP1A2和CYP2B1及一些Ⅱ相代谢酶，包括GT1、GT2和GST具有诱导作用，而对CYP2E1和CYP1A1则表现明显的抑制作用，对人肝微粒体CYP1A2、CYP3A4、CYP2C19、CYP2EI、CYP2D6的活性没有明显影响[6-7]，但甘草次酸可以明显抑制CYP2C19、CYP2C9、CYP3A4的活性[8]。为进一步完善甘草对CYP450酶影响的数据，本文研究了甘草酸二铵对大鼠CYP2C6、CYP2C11和CYP2D2酶活性的影响。

1　材料与方法

1.1主要仪器岛津UV50紫外分光光度计，岛津公司；Q TRAP 2000三重四极杆串联质谱仪，美国Applied Biosystem公司；Agilent 1100高效液相色谱系统，美国Agilent公司。

1.2药品与试剂甘草酸二铵，购于武汉贝尔卡生物医药有限公司；奥美拉唑、5-羟基奥美拉唑、甲苯磺丁脲、4-羟基甲苯磺丁脲、右美沙芬、氧去甲基右美沙芬(纯度均>98.0%)购自Sigma公司；还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)，购自北京鼎国生物技术有限公司，进口分装；牛血清白蛋白，购自上海市浦江应用生物化学研究所，西德进口分装。甲醇、乙腈为色谱纯，购自美国Fisher公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.3动物与处理健康雄性Wistar大鼠18只，体重(200±20)g，随机分成3组，每组6只。苯巴比妥诱导组(苯巴比妥组)：腹腔注射苯巴比妥钠，75 mg/kg，每天1次，连续3 d；空白对照组(对照组)：腹腔注射相同体积生理盐水，每天1次，连续7 d；甘草酸二铵给药组(甘草酸二铵组)，灌胃给予甘草酸二铵，50 mg/kg，每天1次，连续给药7 d。大鼠处死前12 h禁食，末次给药后24 h拉颈处死动物取出肝脏，采用差速离心法制备肝微粒体，用Tris-HCl缓冲液悬浮均匀，分装，于-80 ℃保存待用。

1.4蛋白浓度测定采用Folin-酚法测定蛋白含量[9]。所得蛋白浓度测定标准曲线为C=0.002 6 A，r=0.998。取肝微粒体样品，用0.5 mol/L NaOH稀释适当倍数，取1.0 mL依据标准曲线方法测定吸收度，并根据标准曲线计算蛋白浓度。

1.5CYP450含量测定根据Wang等[10]报道的实验方法测定大鼠肝微粒体CYP450含量。肝微粒体样品用Tris-HCl缓冲液稀释至0.4 mg/mL，分别取2.5 mL放于样品池和参比池中；加入少量Na2S2O4，轻微搅拌，对样品池通CO气体30 s后，于450和490 nm波长处测定吸收度，按Beer定律计算CYP450的含量。计算公式为：CYP450(nmol/mg protein)=(A450-490×1 000/91×C)，其中，A450-490为450和490 nm的吸收度之差，C为被测样品的蛋白浓度(mg/mL)，而CYP450-CO结合物的摩尔消光系数为91 L/(mmol·cm)。本实验双样本分析，求算平均值。

1.6CYP2C6、CYP2C11和CYP2D2酶活性的检测以探针底物法结合液相色谱质谱联用法测定各种酶的活性[11]。CYP2C6、CYP2C11和CYP2D2催化的特异性反应分别为甲苯磺丁脲→4-羟基甲苯磺丁脲、奥美拉唑→5-羟基奥美拉唑和右美沙芬→氧去甲基右美沙芬。以这些反应为基础建立孵化体系。孵育体系总体积为500 μL，其中含大鼠肝微粒体蛋白1.0 mg/mL、NADPH 1.0 mmol/L、MgCl210.0 mmol/L、KCl 10.0 mmol/L，探针底物甲苯磺丁脲、奥美拉唑、右美沙芬的浓度分别为100、5、2.5 μmol/L，孵育时间20 min。反应结束后加预冷的醋酸乙酯2 mL终止反应。根据文献方法测定特异性产物4-羟基甲苯磺丁脲、5-羟基奥美拉唑和氧去甲基右美沙芬的浓度。以单位时间单位蛋白量生成探针代谢物的量[pmol·mg/(protein·min)]。

1.7统计学分析采用SPSS 17.0软件对各组数据进行统计学分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1甘草酸二铵对大鼠肝微粒体蛋白和CYP450含量的影响各组间肝微粒蛋白含量比较差异无统计学意义(P>0.05)，苯巴比妥组CYP450含量明显高于对照组和甘草酸二铵组，差异有统计学意义(P<0.05)，甘草酸二铵组CYP450含量与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1　甘草酸二铵对大鼠肝微粒体蛋白和CYP450含量的影响

注：*与对照组比较，P<0.05

2.2甘草酸二铵对肝微粒体CYP2C6、CYP2C11和CYP2D2酶活性的影响苯巴比妥组3种酶的活性均高于对照组，两组比较差异有统计学意义(P<0.05)。甘草酸二铵组CYP2C6、CYP2C11酶活性与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)，CYP2D2酶活性与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2　甘草酸二铵对CYP2C6、CYP2C11和CYP2D2酶活性的影响

注：*与对照组比较，P<0.05

3　讨论

CYP450酶是人体及动物体内的重要Ⅰ相代谢酶，参与大多数内源性物质和外源性药物的生物转化，而许多药物也会对CYP450酶活性产生抑制或诱导，从而导致药物代谢性相互作用[12]。FDA药物相互作用研究指南中对CYP450酶水平的药物相互作用有着明确的要求。因此，了解药物对CYP450活性的影响对药物开发、临床合理用药指导均有重要意义。

甘草作为传统植物药，在临床上广泛应用，而且常作为芳香剂和甜素添加于食品甚至烟草中。以往的研究已证实，甘草可以通过改变代谢酶活性或表达量而改变其他药物的代谢过程。但甘草对CYP2C6、CYP2C11和CYP2D2酶活性的影响未见报道。CYP2C家族是重要的CYP450酶，参与许多临床药物的代谢。CYP2C约占大鼠CYP总量的55%，其中CYP2C11和CYP2C6分别约占大鼠肝CYP2C总量的50%和20%，在药物代谢中发挥重要作用。研究显示，双香豆素可以抑制这两种酶的活性，从而抑制花生四烯酸的代谢[13-14]。甘草对CYP2C家族酶活性影响的报道结果不一。尽管甘草酸对人CYP2C19活性没有影响，但其体内主要活性成分甘草次酸可以明显抑制CYP2C19和CYP2C9的活性。

本文研究结果显示，甘草酸二铵对大鼠CYP2C11和CYP2C6酶活性有明显抑制作用，由于本研究采用的是大鼠灌胃给药，因而甘草酸二铵的作用也可能是通过其效应成分甘草次酸发挥的。甘草酸二铵制剂是目前应用较多的保肝药物，在与经CYP2C代谢的药物联用时，应根据底物代谢酶特征，选择性地对某些治疗窗窄、安全范围小的药物进行血药浓度监测，适当调节给药剂量，从而达到安全、合理联合用药。

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收稿日期：2015-09-16

DOI:10.14053/j.cnki.ppcr.201603006

Effects of diammonium glycyrrhizinate on the content and activity of CYP450 in rats

ZHANG Ying-ying

(Desect1ment of Pharmacy,Affiliated Hospital of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine,Shenyang 110032,China)

【Abstract】ObjectiveTo study the effect of diammonium glycyrrhizinate on the content of liver microsome protein,cytochrome P450 (CYP450) and the activity of CYP2C6,CYP2C11 and CYP2D2 in cytomicrosome of rat liver.MethodsRats were given diammonium glycyrrhizinate by oral administration [50 mg/(kg·d)] for 7 days,and the content of liver microsome protein,CYP450 and the activity of CYP2C6,CYP2C11 and CYP2D2 in cytomicrosome were detected.ResultsCompared with control group,there was no significant difference in the content of liver microsome protein,CYP450 or the activity of CYP2D2 in treatment group,but there were significant differences in the activities of CYP2C6 and CYP2C11(P<0.05).ConclusionDiammonium glycyrrhizinate can inhibit the activity of CYP2C6 and CYP2C11 in rats.

Key words：Diammonium glycyrrhizzinate; CYP450; CYP2C6; CYP2C11; CYP2D2