隔药灸对UC大鼠血清Th17相关细胞因子的影响*

张　卫　梁世娇　林文敏



【实验研究】

隔药灸对UC大鼠血清Th17相关细胞因子的影响*

张卫1△梁世娇2林文敏3

1.福建中医药大学附属厦门市中医院针灸科(厦门 361009)；2.福建中医药大学针灸学院七年制针灸推拿学硕士研究生2009级(福州 350122)；3.福建中医药大学针灸学院硕士研究生2013级(福州 350122)

摘要：目的探讨隔药灸对溃疡性结肠炎大鼠(UC)血清Th17主要相关细胞因子的调控机制。方法将SD大鼠随机分为正常组、模型组、隔药灸组和西药组4组，采用免疫法加局部刺激造模，用ELISA 法检测大鼠血清IL-17、IL-23、IL- 6、TGF-β、IL-1β和TNF-α的表达水平。结果UC大鼠血清IL-17、IL-23、IL- 6、TNF-α、IL- 1β水平均高于正常大鼠(P<0.05),而TGF-β低于正常组(P<0.05)。经过治疗后，隔药灸组和西药组大鼠血清IL-17、IL-23、IL- 6、TNF-α、IL-1β 均较模型组显著降低(P<0.05)，而TGF-β均较模型组显著升高(P<0.05)。隔药组在下调大鼠血清IL-17、IL-23明显优于西药组(P<0.05)，而在IL- 6、TNF-α、IL-1β、TGF-β的调控上差异无统计学意义(P>0.05)。结论隔药灸能够调控UC大鼠血清Th17主要相关细胞因子的水平，这可能是隔药灸治疗UC的作用机制之一。

关键词：隔药灸；溃疡性结肠炎；Th17；细胞因子

溃疡性结肠炎(UC)是一种非特异性炎症性肠病，免疫反应异常被认为是UC发生发展的核心环节，近年来研究表明Th17主要相关细胞因子,尤其是IL-17/IL-23炎症轴在UC的发病中具有重要的作用[1,2]。临床上我们可以IL-23、IL-17作为新的切入点, 寻找更有效的治疗方法。已有研究表明，隔药灸治疗UC在近期疗效、远期疗效及调节Th1、Th2介导的免疫功能上具有良好的优势。本研究通过观察UC大鼠血清中Th17主要相关细胞因子IL-17、IL-23、IL- 6、TGF-β、TNF-α、IL-1β表达的变化,探讨隔药灸治疗溃疡性结肠炎对Th17主要相关细胞因子的可能作用机理。

1　材料与方法

1.1实验动物选用体质量为(200±10)g的雄性清洁级SD(Sprague Dawley)大鼠44只, 由上海中医药大学动物实验中心提供。所有动物购回后适应性喂养1周后，即纳入实验。实验大鼠随机分为正常组12只、模型组32只。

1.2主要试剂和仪器药饼由附子、肉桂、当归、红花、黄连、木香等中药研末, 加适量黄酒调和, 用特制模具制成直径为0.5cm 的药饼；柳氮磺吡啶(SASP)250mg/片购自上海三维制药有限公司；IL-17、IL-23、IL-6、TGF-β、TNF-α、IL-1βELISA试剂盒购自杭州力拓生物技术有限公司；2%戊巴比妥钠购自北京普博斯生物。ELX808 酶标仪购自美国Bio-Tck公司；低温高速离心机LABOFUGE400R购自德国HERAEUS；ELT-13V-85V34超低温冰箱购自美国HARIS公司。

1.3模型制备和模型鉴定

1.3.1模型制备参照吴焕淦等[3]的方法制备UC大鼠模型, 以UC患者的结肠作为抗原采用免疫学方法制备实验性UC大鼠模型。UC患者的新鲜结肠来自于外科结肠样本,加入适当生理盐水,3000r/min离心30min,上清液提纯测定蛋白质含量, 并与Freund佐剂混合配成乳剂。造模大鼠首次于后足趾皮下注射抗原1ml(蛋白含量6mg),并分别在第10、17、24、31天于前足趾皮下、背部皮下、腹股沟皮下、腹腔内注射抗原1ml(蛋白含量6mg,腹腔内注射不加完全弗氏佐剂),至第38天造模大鼠用2%戊巴比妥钠30mg/kg 腹腔麻醉后, 用3%甲醛2mL灌肠,留置1h,用生理盐水冲洗2次,再用抗原液(12mg/ml不加佐剂)2 ml灌肠,留置2h,生理盐水冲洗。正常组用生理盐水做与模型组相同操作。

1.3.2模型鉴定及分组造模结束后, 随机选取模型组和正常组大鼠各2只断头处死, 通过结肠HE 染色, 鉴定造模是否成功。在确定模型制备成功的基础上,将模型组剩余30只动物随机分为隔药组10只，模型组10只，西药组10只。

1.4分组与治疗

1.4.1正常组(10只)正常大鼠,做与隔药灸组相同的固定。

1.4.2模型组(10只)不作任何治疗,只做与隔药灸组相同的固定。

1.4.3隔药灸组(10只)取穴“天枢(双)”“气海”“中脘”。穴位定位根据《实验针灸学》(林文注,上海科学技术出版社,1994年)。每日隔药饼灸1次,每次每穴灸2壮,共灸14天。

1.4.4西药组(10只)柳氮磺胺吡啶(SASP)溶液灌胃。每日投药量按成人(70kg 体质量)与大鼠(200 g体质量)1∶0.018比例根据《中药药理实验方法学》(李仪奎,上海科学技术出版社,1991年)配制SASP溶液,每次灌胃3 ml,每日2次,共灌胃14天。

治疗结束后, 用2%戊巴比妥钠腹腔麻醉，心脏取血6 ml，注入肝素抗凝管内，3600转/分钟离心15 min，取上层血清3ml，测定各组细胞因子含量，取血结束后各组大鼠断颈处死。

1.5检测指标采用ELISA法检测大鼠血清IL-17、IL-23、IL-6、TGF-β、TNF-α、IL-1β含量，具体步骤按ELISA试剂盒操作。

2　结果

各组大鼠血清IL-17、IL-23、IL-1βIL-6、TNF-α、TGF-β的水平，结果见表1、表2。

表1　大鼠血清IL-17、IL-23、IL-1β水平　(ng/L)

注：1)与正常组比较P<0.05；2)与模型组比较P<0.05;3)与西药组比较P<0.05

表2　大鼠血清IL-6、TNF-α、TGF-β水平 　(ng/L)

注：1)与正常组比较P<0.05；2)与模型组比较P<0.05

3　讨论

在中医学中，根据临床特点,UC当属中医“下利”“肠澼”“痢疾”“腹痛”“便血”“脏毒”等范畴。

多位学者认为本病病位标在大肠，本在脾肾，其病机主要以脾肾阳虚为本，瘀血阻滞为标，且他们采用温肾健脾、 益气活血为主要治法均取得了良好的疗效[4～6]。故我们采用隔药灸治疗UC，以脏腑、气血、经络为依据,以腧穴功效为基础,以温补脾肾,疏调肠腑气血为治疗原则进行针灸处方,采用通十二经、理气血之艾叶作为施灸材料,并设计制作了温阳、行气活血之药饼,在气海、中脘、天枢等穴进行治疗。

UC多因脾胃虚弱复感外邪、饮食不洁、情志不畅，导致肠腑气机失调，发为腹泻。失治误治，反复发作，久泻不愈，必伤及肾，引起脾肾阳虚，加重腹泻。《景岳全书·泄泻》曰：“肾为胃之关，开窍于二阴，所以二便之开闭，皆肾脏所主，今肾中阳气不足，则命门火衰……即令人洞泄不止也。”然古人云“久泻无火”，即久泻可肾阳损伤，肾阳不足，命门火衰，不能温煦脾阳，虚寒内生，运化失调，可见泻下不止或鸡鸣泻，泄泻与脾肾相互作用，形成恶性循环，导致本病迁延难愈。又《景岳全书·杂证谟》载：“凡里急后重者，病在广肠最下处，而其病本，则不在广肠，而在脾肾……欲治此者，但当察其所因，以治脾肾之本”，可见里急后重与脾肾相关。故笔者认为本病病位在肠，与脾胃密切相关，久必及肾，属本虚标实之证，脾肾阳气在发病中起关键作用，故脾肾阳虚为本病的主要证侯。故本研究选穴气海、中脘、天枢寓意标本兼治，三穴配合共奏温养脾肾、通调气血、调和阴阳之功。

研究表明隔药灸在治疗UC具有可靠的疗效，同时可以纠正结肠黏膜病变, 近期痊愈率达52.5 %[7]。相关机理研究显示隔药灸可以调整UC大鼠的肠道菌群紊乱，并可有效抑制TNF-α、IL-12的过度表达[8]；可以调节IL-1β等诸多基因的表达、下调溃疡性结肠炎患者结肠黏膜组织IL-8及其mRNA的表达[9], 抑制ICAM-1及其mRNA 的表达[10]等等，从而起到治疗作用。

为进一步探讨隔药灸治疗UC的作用机理，本实验采用ELISA法检测大鼠血清IL-17、IL-23、IL-6、TGF-β、TNF-α、IL-1β水平及隔药灸的影响进行了研究。

本项研究结果显示模型组、隔药灸组、西药组UC大鼠血清促炎因子IL-17、IL-23、IL- 6、TNF-α、IL-1β水平明显高于正常组，与大多数研究者的结果一致，同时隔药灸组、西药组较模型组的表达水平降低。表明隔药灸能够降低UC大鼠结肠血清异常增高的IL-17、IL-23、IL- 6、TNF-α、IL-1β的表达, 提示隔药灸治疗UC大鼠的可能途径之一是通过调控促炎性细胞因子IL-17、IL-23、IL- 6、TNF-α、IL-1β的表达, 来减轻或消除肠道炎症。UC大鼠血清TGF-β水平较正常组显著降低，抗炎作用减弱，导致结肠炎性反应的加剧，同时通过隔药灸可以上调UC大鼠血清TGF-β水平抑制炎症的发展。本研究还显示隔药灸组血清IL-17、IL-23的表达较西药组的降低，IL-23、IL-17是IL-23/IL-17轴主要的炎症因子，研究提示隔药灸组在降低血清的IL-17、IL-23水平优于西药组，笔者认为这可能是隔药灸治疗UC的优势之一。

综上，本研究提示隔药灸能够调控UC大鼠血清Th17主要相关细胞因子的水平，这可能是隔药灸治疗UC的主要机制之一。在相关TGF-β的研究中，经过治疗后UC大鼠TGF-β血清含量有升也有降，在本研究中，TGF-β在UC大鼠血清表达明显降低。有学者认为TGF-β在溃疡性结肠炎的早期起着抗炎作用，之后则起着促炎的作用，故TGF-β在UC大鼠发病中的作用机制还有待进一步研究。

参考文献

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*基金项目：厦门市科技局指导项目(No.ZD2011S0390)

通讯作者△

doi:10.3969/j.issn.1003-8914.2016.08.018

文章编号：1003-8914(2016)-08-1091-04

收稿日期：(本文校对：叶清景2015-09-01)

Effects of Herb-partitioned Moxibustion of Thl7 Major Related Cytokines

ZHANG Wei1△LIANG Shijiao2LIN Wenmin3

(1.Department of Acupuncture and Moxibustion, Xiamen Hospital of TCM affiliated to Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fujian, Xiamen 361009, China；2.Grade 2009 Graduate of Seven-year System, College of Acupuncture and Tuna,Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fujian, Fuzhou 350122, China；3. Grade 2013 Graduate, College of Acupuncture and Tuna, Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fujian, Fuzhou 350122, China)

Abstract：ObjectiveTo explore the regulatory mechanism of herb-partitioned moxibustion of Thl7 major related cytokines on the serum of ulcerative colitis (UC) rats. MethodsSD rats were randomly divided into normal group, model group, herb-partitioned moxibustion group and medicine group. A rat model of UC was made by an immunological method plus local stimulation. The serum levels of IL-17, IL-23, IL- 6, TGF-β, IL-1β and TNF-α were detected by ELISA method. Result Serum levels of IL-17, IL-23, IL- 6, IL-1β and TNF-α in UC rats were higher than those in the normal group (P<0.05), whereas the serum level of TGF-β was lower than that of the normal group (P<0.05). After treatment, levels of IL-17, IL-23, IL- 6, IL-1β and TNF-α of herb-partitioned moxibustion group and medicine group decreased obviously when comparing with model group (P<0.05), and TGF-β increased obviously (P<0.05) in the serum of both the herb-partitioned moxibustion group and medicine group comparing with the model group. Comparing with the medicine group, serum levels of IL-17 and IL-23 of the herb-partitioned moxibustion group decreased obviously (P<0.05), and there was no statistical significance (P>0.05) in the level of TGF-β, IL-1β and TNF-α. Conclusion Herb-partitioned moxibustion can regulate levels of Thl7 major related cytokines in the serum of UC Rats. This may be one of the mechanisms of herb-partitioned moxibustion treatment for UC.

Key words：Herb-partitioned moxibustion; Ulcerative colitis; Th17; Cytokine