绵羊脑炎单增李斯特菌生物膜形成及相关基因的检测

邬　琴，闫圆圆，王　振，梁淋渊，郑婷婷，孔科委，王熙楚，周　霞

(石河子大学动物科技学院，新疆石河子 832000)



绵羊脑炎单增李斯特菌生物膜形成及相关基因的检测

邬琴，闫圆圆，王振，梁淋渊，郑婷婷，孔科委，王熙楚，周霞*

(石河子大学动物科技学院，新疆石河子 832000)

摘要：为了检测绵羊脑炎李斯特菌生物膜形成情况并确定生物膜形成相关基因在该菌中的分布情况，采用结晶紫染色结合测定OD值的方法观察羊脑炎李斯特菌生物膜在不同时间段形成情况,并应用分子生物学方法检测生物膜形成相关基因(flaA、recA、relA、prfA、yneA、agrA、luxS、degU、motB、sigB、hpt)在该菌中的分布情况。结果表明，在37 ℃，绵羊脑炎李斯特菌生物膜在2 h～8 h的OD值与0 h和对照组对比差异显著(P<0.05)， 9 h～48 h OD值呈平稳趋势，与对照组比较差异显著(P<0.05)。2 h开始生物膜初具形态，呈现散落的网格结构，2 h～6 h矩阵网格结构明显，6 h～8 h形成高度有序的网格结构，9 h～48 h依然具备生物膜网状结构特征，但个别网状结构脱落。11种生物膜相关基因在绵羊脑炎李斯特菌中的检测结果为阳性，测序结果与GenBank公布的相应序列同源性为87.22%～99.29%。结果表明2 h～6 h生物膜进入黏附期和生长期，6 h～8 h进入成熟稳定阶段，9 h～48 h逐渐进入播散期；LM90携带11种与生物膜形成相关的基因。

关键词：绵羊脑炎李斯特菌；生物膜；膜相关基因

李斯特菌病(Listeriosis)是由单核细胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes,LM)引起的一种具有重要公共卫生意义的动物源性和食源性人畜共患病，该病发病率低,但病死率高。在兽医临床中可引起绵羊的“转圈病”。细菌生物膜(bacterial biofilm,BBF)是指细菌为了适应生存环境，包裹于细胞外多聚物基质中的黏附于非生物或生物表面的微生物群落[1-2]。胞外多糖是细菌生物膜的主要组成部分和结构支架，可为细菌生长提供营养，并对细菌的黏附、聚集、成膜等发挥重要作用，亦可增强细菌对宿主免疫系统和外界环境的抵抗力[3-4]。近年来，随着对细菌耐药机制的研究，发现微生物生物膜与细菌的耐药性密切相关。以生物膜形式存在的细菌，对抗生素的抗性会提高10倍～1 000倍，是造成当前细菌感染加重的主要原因之一[5-6]。研究表明不同来源单增李斯特菌也能不同程度形成生物膜，且与该细菌的生存能力、致病性密切相关。根据国内外的研究，在细菌引发感染过程中有众多的基因参与生物膜的形成，起始黏附阶段和生物膜成熟形成阶段的生物膜形成量均受到特定的相关基因转录和表达的控制，其中主要有flaA、recA、relA、prfA、yneA、agrA、luxS、degU、motB、sigB及hpt[7]。然而不同来源菌株携带相关基因情况也不同。

本研究以从发生脑炎绵羊大脑中分离得到的单核细胞增生李斯特菌90(LM90)为研究对象，采用结晶紫染色法定量和定性检测分离株生物膜形成特点，其次应用分子生物学方法检测生物膜形成相关基因在LM90中的分布情况，分析医学临床和兽医临床LM分离株相应基因片段的同源性，为动物来源单核细胞增生李斯特菌生物膜形成及致病性研究奠定基础。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1菌株单核细胞增生李斯特菌LM90菌株为石河子大学动物科技学院预防兽医学实验室从发生“转圈病”绵羊大脑分离鉴定并保存。

1.1.2主要仪器和试剂超净工作台，上海博讯实业公司产品；酶标仪，美国BioTek公司产品；PCR仪，赛默飞世尔科技公司产品；倒置显微镜，上海光学仪器公司产品；96孔细胞培养板、BHI培养基、结晶紫及2×TaqPCR Master Mix等相关试剂均，广州东盛生物科技有限公司产品。

1.2方法

1.2.1LM90生物被膜的制备采用96孔板进行细菌培养，试验组取20 μL菌液加入180 μL BHI培养基中，对照组加200 μL的BHI培养基，在37 ℃温箱中分别培养2、4、6、8、9、12、24、36、48 h。1.2.2生物被膜及吸光值的测定在不同培养时段，弃去培养基并用PBS冲洗，60℃的烘箱中烘干1 h后每个孔加入50 μL结晶紫染色15 min，洗涤后加入200 μL的乙醇-丙酮脱色，测595 nm处的OD值，3个平行样，记录平均值，并进行单因素方差分析。1.2.3生物被膜形态结构观察在不同时间段培养结束后，弃去培养基，PBS冲洗后温箱中烘干，用10 g/L的结晶紫染色15 min后，冲洗后烘干并在倒置显微镜观察LM90在2、4、6、8、9、12、24、36、48 h内生物膜结构并采集图像。

1.2.4LM90生物被膜形成相关基因的检测及分析11种基因(flaA、recA、relA、prfA、yneA、agrA、luxS、degU、motB、sigB和hpt)引物参照文献[7]由北京华诺科技有限公司合成。PCR反应程序：预变性94℃ 5 min；94℃ 1 min，复性温度根据引物的Tm值确定，1 min，延伸72℃时间根据条带大小确定(30 s～80 s)，30个循环；72℃ 10 min。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，回收电泳产物并送北京华诺科技公司测序，结果用DNA Star 14.0软件分析。

2　结果

2.1LM90在不同时间段形成生物被膜OD值测定结果

试验组0 h～8 h的OD值逐渐升高,与0 h和对照组比较，差异显著(P<0.05)；9 h～48 h的OD值不再大幅度增加，之后呈现平稳趋势，与对照组比较，差异显著(P<0.05)(图1)。

图1　LM90在不同培养时间内生物被膜形成情况

2.2LM90形成生物被膜形态的显微镜观察结果

2 h开始LM90生物膜初具形态，可见菌体呈现散落的网格结构，有继续生长成网格状的趋势(图2A)；4 h可见大量的菌体附着在表面，并且菌体呈现连续的网状结构，网格结构更加明显(图2B)；6 h见更为清晰的矩阵网格结构(图2C)，8 h可见高度有序的矩阵网格结构(图2D)；9 h～48 h可见零星散落的网状结构,个别地方脱落，但依然具备生物膜网状结构特征(图2E、图2F、图2G、图2H)。这些结果表明，生物膜在2 h就开始初步形成，此时处于浮游状态细菌初始黏附期，2 h～6 h黏附细菌逐渐增厚堆积进入黏附期和生长期，逐渐生成较为封闭的矩阵网格结构，6 h～8 h生物膜基本处于成熟稳定期，生成较为完整的三维网格结构，9 h～48 h生物膜的完整性大大降低，此时细菌从生物膜或载体表面释放散播，生物膜处于播散期。

A.2 h；B.4 h；C.6 h；D.8 h；E.9 h；F.12 h；G.24 h；H.36 h；I.48 h

2.3生物膜形成相关基因检测结果

扩增LM90 11个基因flaA(864 bp)、recA(1 047 bp)、relA(2 217 bp)、prfA(1 077 bp)、yneA(330 bp)、agrA(729 bp)、luxS(468 bp)、degU(687 bp)、motB(828 bp)、sigB(780 bp)、hpt(1 386 bp),结果均扩增到了相应的基因片段(图3)。

2.411个基因序列测定及同源性分析结果

LM90生物膜形成相关的11种基因扩增片段

进行测序和分析，与GenBank公布的分离株Listeriamonocytogenesserotype 4b str.LL195等菌株的相应序列之间的同源性在87.22%～99.29%。部分结果见图4。

M．DNA标准 DL 2 000； 1～5.motB、sigB、prfA、degU、yneX; 6～11.luxS、flaA、relA、recA、hpt、agrA为基因PCR扩增产物M.DNA Marker DL 2 000；1-5.PCR products of motB，sigB，prfA，degU，yneX genes; 6-11.PCR products of luxS，flaA，relA，recA，hpt genes

图3LM90 11种基因PCR扩增结果

Fig.3PCR amplified rusults of 11 genes from LM90

HF558398.1、FR733646.1、FR733645.1和FR73362.2为GenBank公布的不同来源LM luxS和sigB基因的相应序列

3　讨论

李斯特菌为短小的革兰阳性无芽胞兼性厌氧杆菌，近十几年,国内外李斯特菌病呈流行趋势,它是一种具重要公共卫生意义的动物源性和食源性人畜共患病，危害很大[8]。近年来，随着对细菌感染所致的一些慢性和顽固性疾病的深入研究,发现生物膜是导致这些细菌性疾病久治不愈和反复发作的主要原因。细菌形成生物膜后,具生物膜细胞间有着严密的化学信号传导交流信息，有着致密的三维立体空间结构，能逃避宿主免疫系统的攻击，并对抗菌药物产生耐药性[9-11]。生物膜形成的过程可分为几个关键阶段，浮游状态细菌的可逆黏附期，细菌生长繁殖逐渐增厚堆积的不可逆生长期；在经历不可逆黏附阶段后进入成熟期，最终从生物膜或载体表面释放出来播散并定植到新的其他表面物质的播散期[7]。本研究采用结晶紫染色法结合倒置显微镜对生物膜的结构特点进行观察，结果表明，在2 h浮游的细菌生长繁殖并开始黏附聚集在载体表面，这一过程为细菌起始黏附阶段；2 h～6 h细菌在营养充足的条件下OD值逐渐增加意味着细菌大量生长繁殖，黏附细菌逐渐增厚堆积在载体表面，逐渐生成较为封闭的矩阵网状结构，随着时间的推移逐渐进入黏附期和生长期；6 h～8 h细菌形成高度有组织的网格结构,此时生物膜基本处于成熟稳定阶段；9 h～48 h生物膜的完整性下降，而且此时的OD值不再大幅度增加，呈现平稳趋势，9 h后成熟生物膜通过蔓延、部分脱落等方式进行扩展,从生物膜中脱落或释放出来的细菌又可在物体表面形成新的生物膜，该过程有利于生物膜的繁殖及群落的自我重建。然而在固定培养基中因为营养物质被大量消耗，很难再形成较为完整的生物膜结构，所以OD值呈现平稳趋势,处于生物膜的播散期。本研究结果也显示细菌生物膜结构随着时间的推移逐渐形成高度有组织网状的结构，最后趋于稳定状态，这与李燕杰等[7,12]研究结果类似。国外研究报道，在生物膜形成阶段中，参与生物膜早期形成、晚期成熟与播散阶段的基因主要包括flaA、motB、sigB、degU、agrA、agrD、luxS、yneA、recA、relA、hpt及prfA 等基因[7]。本研究结果表明，与李斯特菌生物膜形成相关的11个基因flaA、recA、relA、prfA、yneA、agrA、luxS、degU、motB、sigB及hpt,皆存在于绵羊脑炎李斯特菌LM90中，但这些基因在LM90生物膜形成中的详细作用还需进一步研究。

参考文献：

[1]Høiby H.A personal history of research on microbial biofilms and biofilm infections[J].Pathog Dis,2014,70(3)：205-211.

[2]崔海英，张雪婧，赵呈婷,等．细菌生物膜的研究进展[J].江苏农业科学， 2015,43(8):11-14.

[3]刘红艳，韦曦，凌均棨.饥饿状态粪肠球菌生物膜胞外多糖的合成能力[J].中华口腔医学研究杂志：电子版，2012，6(5):416-420.

[4]Flemming H C,Wingender J． The biofilm matrix[J]．Nat Rev Microbial，2010，8(9)：623-633.

[5]黄伟，李旭廷，刘兴福.细菌生物膜与细菌耐药性研究进展[J].畜牧与饲料科学，2012，33(8):81-83.

[6]罗锐军，陆春，李纪兵.生物膜耐药机制进展[J].微生物学杂志，2014,34(1):92-95.

[7]叶正兴，王艳，李培京,等.单增李斯特菌1/2a血清型菌株生物膜形成能力及相关基因差异研究[J].中国人兽共患病学报，2013，29(4):354-360.

[8]Allerberger F,Wagnr M.Listerosis a resurgent foodborn infection[j].Clin Microbol Infect,2010,16(1):16-23.

[9]Alhede M,Er Ö,Eickhardt S,et al.Bacterial biofilm formation and treatment in soft tissue fillers[J].Pathog Dis,2014,70(3):339-346.

[10]Loo C Y,Young P M,Cavaliere R,et al.Silver nanoparticles enhancePseudomonasaeruginosaPAO1 biofilm detachment[J].Drug Dev Ind Pharm,2014,40(6):719-729.

[11]欧阳净，熊丽蓉，冯伟，等.表皮葡萄球菌生物膜抑制肽对该菌粘附及生物膜形成的影响[J].中华烧伤杂志，2015，31(4):285-289.

[12]李燕杰，朱小花，夏雨，等.不同培养条件对单增李斯特菌生物被膜形成的影响研究[J].食品研究与开发，2010，31(11):188-192.

收稿日期：2016-01-02

基金项目：石河子大学“大学生研究训练计划”(SRP2015215)；国家自然科学基金项目(31160507)

作者简介：邬琴(1993-)，女，新疆富蕴人，本科生在读，动物医学专业。*通讯作者

中图分类号:S852.615

文献标识码:A

文章编号:1007-5038(2016)07-0013-04

Detection on Biofilm Formation and Biofilm-associated Genes ofListeriamonocytogenesInducting Encephalitis in Sheep

WU Qin,YAN Yuan-yuan,WANG Zhen，LIANG Lin-yuan,ZHENG Ting-ting,KONG Ke-wei,WANG Xi-chu,ZHOU Xia

(CollegeofAnimalScienceandTechnology,ShiheziUniversity,Shihezi，Xinjiang， 832000,China)

Abstract:In orderto detect the biofilm formation and distribution of biofilm-associated genes of Listeria monocytogenes inducting encephalitis in sheep,the methods of crystal violet staining and OD value determination were used to observe the biofilm formation in different period of time and detect distribution of biofilm-associated genes(flaA，recA，relA，prfA，yneA，agrA，luxS，degU，motB，sigB，hpt) by molecular biological ways.The results showed that at 37 ℃,compared with the control group and 0 h,the biofilm OD in 2 h-8 h is significantly different (P<0.05),meanwhile,OD values in 9 h-48 h showing a stable trend is also significantly different(P<0.05).The biofilm began to be formed,showing lattice structure in the first 2 h,being more obvious for 2 h-6 h,forming highly ordered lattice structure for 6 h-8 h,maintaining the lattice structure characteristics while the individual mesh structure fell off during 9 h-48 h.11 biofilm-associated genes were positive in the detection，both sequence in this test and the homology published in Genbank are 87.22%-99.29%.The results showed that in 2 h-6 h the biofilm started the first step of attachment and development,in 6 h-8 h being the second one of maturation,and in 9 h-48 h being the next step of detachment,where LM90 carried 11 biofilm-associated genes.

Key words:Listeria monocytogenes inducting encephalitis in sheep; biofilm; biofilm-associated gene