草鱼呼肠病毒研究进展

李　贤，曾伟伟，王　庆，王英英，李莹莹，石存斌，吴淑勤

(1.中国水产科学研究院珠江水产研究所，农业部渔药创制重点实验室，广东省水生动物免疫重点实验室，广东广州 510380；2.上海海洋大学水产与生命学院，上海 201306)



草鱼呼肠病毒研究进展

李贤1,2，曾伟伟1*，王庆1，王英英1，李莹莹1，石存斌1，吴淑勤1*

(1.中国水产科学研究院珠江水产研究所，农业部渔药创制重点实验室，广东省水生动物免疫重点实验室，广东广州 510380；2.上海海洋大学水产与生命学院，上海 201306)

摘要：由草鱼呼肠病毒引起的草鱼出血病是一种高度传染性与致死性的病毒性疾病，该病的频繁暴发给我国草鱼养殖业及淡水养殖业造成了巨大的经济损失。论文就近年来对草鱼呼肠病毒在基因组序列及基因分型、流行病学、先天性免疫、检测方法、免疫防控等方面的研究进行综述，以期为草鱼呼肠病毒的研究提供借鉴和参考，为草鱼出血病预防和控制提供帮助。

关键词：草鱼呼肠病毒；基因组；流行病学；先天性免疫；检测方法

草鱼呼肠病毒(Grass carp reovirus，GCRV)主要引起中国、越南、缅甸等亚洲国家淡水养殖中的草鱼在鱼种阶段发生草鱼出血病，病死率一般为 30%～50%，最高可达90%，而且还能感染青鱼、麦穗鱼、布氏鳌条鱼等，使感染鱼发生出血病症状而死亡。该病毒流行广，死亡率高、发病季节长，严重影响了我国淡水养殖业的健康发展。近年来经常可见因草鱼出血病暴发而导致大批草鱼死亡，给养殖户造成巨大经济损失。据不完全统计，每年由于草鱼出血病导致的经济损失达10 多亿元，该病的基础研究及其防控受到越来越多人的重视。

1　GCRV基因组序列

草鱼呼肠病毒的基因组由11条双链分段的RNA组成，共编码7种结构蛋白和5种非结构蛋白。基因组各节段具有5′末端帽子结构，3′末端不具有Poly (A)尾序列。2002年，Attoui等完成了GCRV-873株的全基因组测序，是第一株完成全基因组序列分析的草鱼呼肠病毒，同年还完成了GSRV的全基因组测序。2008年，Mohd等完成了AGCRV的全基因组序列测定。2010年，张超等完成了GCRV-HZ08毒株的全基因组测序。2012年，Ye等完成了GCRV-GD108株的全基因组测序。2013年，Pei Chao等[1]完成了GCRV-109的全基因组测序；Fan Yuding等[2]完成了GCRV-106、GCRV-918、GCRV-HeNan988、GCRV-HuNan794、GCRV 104[2]的全基因组测序。2013年-2015年，Wang Tu等[3]完成了GCRV JX02株的全基因组序列测定。至今完成全基因组序列测定的毒株已有12株(表1)，有一些毒株则根据研究者自身研究需要完成了部分节段的测序(表2)。2000年，Qiu等完成了GCRV的S1、S2、S3、S8、S10节段的基因组测序；2001年，Qiu完成了GCHV的S2、S3、S5、S6、S7、S9、S11节段的基因组测序；2013年，Jian等完成了GCRV-096的S6、S10节段的基因组测序； Ying等完成了GCRV-ZS11、GCRV-YX11、GCRV-QY12、GCRV-QC11、GCRV-NC11、GCRV-JS12、GCRV-HS11、GCRV-HN12的S9节段的基因组测序；Wang等完成了JX02的S10节段的基因组测序。

2　GCRV基因分型和流行病学调查

关于草鱼呼肠病毒的基因分型研究，不少学者都进行过尝试，但没能得出一个确定的结果，也没有一个确定的方法或标准，多数是根据核苷酸序列或推导的氨基酸序列进行同源性比对并构建系统进化树来进行分析，各人所选用的节段或蛋白也并不相同。Pei Chao等[1]研究了GCReV-109株的蛋白序列，发现GCReV-109和GCRV-GD108有96.6%～99.5%的相似率，但与GCRV-873和HGDRV的相似率分别只有16.7%～46.1%和15.1%～45.4%。系统发育树分析显示中国的草鱼呼肠病毒株可以分为3个基因型，蛋白GCReV-109 VP56和HGDRV VP55有同族关系，GCReV-109 NS38、GCRV-873NS38、HGDRVVP39有同族关系。这些结果表明病毒间的同族关系和地理分布没有必然联系。曾伟伟等报道根据现有的分离株序列信息，进行核苷酸序列与氨基酸序列比对并构建系统进化树分析，把这3类毒株按照基因序列差异分为I型(代表株为GCRV-873与GCRV-873-JX09-01)、Ⅱ型(代表株为GCRV-HZ08与GCRV-GD10)和Ⅲ型(GCRV-104，GCRV-HB1007)。不同类型的毒株其核苷酸和氨基酸序列的同源性都小于30%，而同一类型的毒株其核苷酸和氨基酸序列的同源性都大于95%。Wang等的分析表明HZ08株的第2完整片段和GCRV GD108 (AQRV)，GCRV 873 (AQRV-C)，金体美鳊呼肠病毒 (GSRV,AQRV-C)，美国草鱼呼肠病毒(AGCRV，AQRV-G)，大马哈鱼呼肠病毒 (CSRV，AQRV-A)，和GCRV 104 (未分类)相应片段的相似率分别是96.4%、51.7%、51.3%、50.9%、50.6%和49.7% 。基于VP6的核酸序列可把病毒分为3组，即GCRV 873 (基因Ⅰ型)，HZ08(基因Ⅱ型)和104 (基因Ⅲ型)，3个基因型间的相似性小于20%。基因Ⅰ型包括5个分离株873、096、875、876、991，相似性从72.5%～99.7%，基因Ⅱ型包括3个分离株HZ08，GD108和HA-2011，相似性从72.6%～98.7%，基因Ⅲ型只有一个分离株GCRV104，与GCRV873和HZ08比较相似性分别是19.2%和16.5%。Yan Xiuying等[4]研究用VP4、VP6、VP7的序列去分析25个分离的GCRV的序列差异，亲缘关系和基因型。结果显示，这25个GCRV分离株可分为4个基因，在GCRV中，相对保守的VP4、VP6和VP7基因编码大部分外壳蛋白包括很多可变位点。所以，VP4、VP6和VP7能用作GCRV基因分型。GCRV096、GCRV JX01、GCRV 873、GCRV 875、GCRV 876和 GCRV 991是基因Ⅰ型，AGCRV 和 AGCRV PB01-155是基因Ⅱ型，GCRV HZ08、GCRV GD108、GCRV 918、GCRV HuNan794、GCRV HeNan988、GCRV 106、GCRV ZS11、GCRV QC11、GCRV HN12、GCRV HS11、GCRV YX11、GCRV JS12、GCRV QY12、GCRV JX02和 GCRV 097是基因Ⅲ型，GCRV104 是基因Ⅳ型。以上这些研究都表明在中国有至少3个基因型的草鱼呼肠病毒。

表2　完成部分节段测序的草鱼呼肠病毒及其信息

病毒名称Virus测序片段Segments片段大小/bpFragmentsizeGenBank登录号Accession№测定时间DeterminedtimeGCRV-JX01S10909JX0428072013GCRVS13949AF260511S12000GCRVS23877AF260511S22000GCRVS33702AF260511S32000GCRVS81287AF2590532000GCRVS10909AF2366882001GCRV-ZS11S91257KC1300822013GCRV-YX11S91257KC1300812013GCRV-QY12S91257KC1300802013GCRV-QC11S91257KC1300792013GCRV-NC11S91257KC1300782013GCRV-JS12S91257KC1300772013GCRV-HS11S91257KC1300762013GCRV-HN12S91257KC1300752013GCRV-096S61981JN2066642013GCRV-096S10855JN2066652012GrasscarphemorrhagicvirusS33702AF2845032000GrasscarphemorrhagicvirusS23877AF2845022000GrasscarphemorrhagicvirusS91130AF2845042003GrasscarphemorrhagicvirusS71414AF2391742000GrasscarphemorrhagicvirusS11820AF2343212000GrasscarphemorrhagicvirusS52239AF2512622000GrasscarphemorrhagicvirusS62039AF2391752001GrasscarphemorrhagicvirusS10909AF2366882001

草鱼呼肠病毒的流行具有典型的季节性，其主要原因在于该病毒的聚合酶最适温度为28℃，因此，草鱼出血病的高发期就主要是在夏季，其水温为25℃～30℃时最易暴发。在很多高密度饲养的草鱼种池，当水的温度超过24℃时，病毒增殖迅速，可对鱼体的免疫系统发生作用，致使鱼体发生严重的功能障碍导致死亡。而在水温低于20℃时，病毒的增殖会受到抑制甚至部分病毒会失去感染性，但大多可以保留其抗原性，因此，在低温环境时，鱼体在携带病毒的情况下可产生特异性抗体，即使温度回暖再感染强毒，也可耐过，所以草鱼出血病大多只在气候温暖的南方水域发生，而在我国北方罕见。曾伟伟[5]等建立了三重PCR检测技术，利用建立的三重PCR方法对2009年-2011年期间从全国各地收集的草鱼出血病病料进行检测和初步流行病学分析，结果表明，Ⅰ型阳性率 为9.3%，Ⅱ型阳性率为45.3%，Ⅲ型阳性率为2.3%，Ⅰ型和Ⅱ型混合感染阳性率为5.8%，Ⅱ和Ⅲ型混合感染阳性率为2.3%，其他类型的混合感染未检测到。表明目前主要流行的草鱼呼肠病毒为Ⅱ型。

3　抗草鱼呼肠病毒免疫相关因子

作为机体免疫重要组成部分的免疫相关因子，已经被广泛研究。在草鱼上，主要研究了与先天性免疫有关的基因(蛋白)、信号通道基因(蛋白)、调节基因(蛋白)等。Feng Xiaoli等[6]进行了关于草鱼TBK1基因的研究，TBK1基因是一种诱导IFN分化的信号通路激酶，TBK1的过度表达能通过诱导IFN-Ⅰ和Mx1的产生来抑制病毒感染，参与抗病毒和抗菌的免疫应答，同时它能调节自身平衡以避免过度活化产生的不良效果，在抗病毒和抗菌的先天性免疫中起重要作用；Feng Xiaoli等[7]还进行了关于IFN刺激物STING的研究，STING是一种重要的RLR通路响应调节物，通过抑制GCRV生成而表现出有抗病毒的活性，它不仅能通过IFN-依赖通路应答dsRNA类似物，而且能通过IFN-Ⅰ独立通路应答病毒和细菌的PAMPs，在先天性免疫中有非常重要的作用；Cai Jia等[8]进行了关于N4BP1基因应答GCRV感染的研究，N4BP1蛋白是一种交互蛋白，同时也是N4E3连接酶的一种底物，GCRV感染后，N4BP1会上调，在CIK细胞系中超表达来抑制病毒基因转录，在病毒入侵的免疫应答中起重要作用； Chen等进行了关于RIG-I基因的研究，RIG-I是一种重要的检测核苷酸病原相关分子模式的胞质模式识别受体，同时在先天性免疫应答中调节IFN-Ⅰ和诱导促炎性细胞因子，试验用qRT-PCR方法检测经GCRV或病毒PAMP攻毒和细菌PAMPs刺激后相关因子mRNA的表达量，结果表明RIG-Ⅰ对dsRNA、细菌PAMPs都有应答,在抗病毒和抗菌的先天性免疫中发挥重要作用；Peng等做了关于Mx蛋白的研究，Mx蛋白通过IFN-Ⅰ信号通路调节在抗多种病毒的先天性免疫应答中起重要作用，试验用RT-qPCR检测了经GCRV感染后的3种Mx和IFN-Ⅰ基因的表达，结果表明4种基因都表达了，Mx的表达与IFN-Ⅰ的表达无相关性，研究显示Mx基因能抑制GCRV的复制，它的超表达调节IFN-Ⅰ基因的反馈抑制行为；Su等进行了骨髓分化因子88(MyD88)的研究，试验克隆了一段草鱼全长MyD88的cDNA，用GCRV感染发现MyD88表达上调，分析表明MyD88或许参与了草鱼的抗病毒免疫防御；Su等进行了细胞质解旋酶蛋白MDA5(黑素瘤分化关联基因5)的研究，表明MDA5能识别dsRNA和ssRNA长分子，调节IFN-I的分泌，注射GCRV后用半定量RT-PCR检测，MDA5的mRNA表达上调，分析表明在草鱼中MDA5参与了早期的抗GCRV的抗病毒先天免疫防御； Pei Y Y等[9]研究用GCRV和LPS刺激草鱼，发现GCRV刺激后，草鱼组织中的TLR4水平出现了不同程度的上调，LPS刺激后，TLR4出现了下调的现象；Yu Xiaobo等[10]通过化学方法获得2种远志的甲醇提取物，分别刺激草鱼肾细胞系(CIK)并测定免疫基因(Mx1、IL-1b、TNFa、MyD88和IgM)水平，化合物1和2都能使Mx1，IL-1b，TNFa和MyD88出现不同程度上调，且化合物2(3，4，5-三甲氧基肉桂酸)比化合物1(1，5-脱水-D-山梨醇)效果更显著。结果表明这些化合物能调节免疫相关基因，一定程度上产生消灭病毒和寄生虫感染的效果；Jiang Yao等[11]用鞭毛蛋白和GCRV刺激草鱼，CiTLR5a和CiTLR5b水平都显著上调了，其他的MyD88、NF-κB、IRF7、IL-1β和TNF-α也上调了，说明CiTLR5a和CiTLR5b参与了鞭毛蛋白和GCRV刺激的应答反应；Li Yan等[12]用GCRV感染刺激草鱼CIK细胞系，发现能引起CiTrap1水平的上调，同时这项研究结果表明，CiTrap1参与宿主的先天性抗病毒感染应答反应可能是通过保护受感染的细胞凋亡来实现的。这些结果显示了草鱼体内的先天性免疫因子在抗病毒感染上的变化和作用，或许我们可通过刺激诱导草鱼的先天性免疫来增强草鱼的抗GCRV能力。

在研究过程中，有些学者发现某些基因型的特点或许可以在选育抗草鱼呼肠病毒的草鱼苗种上提供参考，这为防治草鱼出血病提供了新思路。Wan等进行了关于IPS-1基因的研究，IFN-β启动刺激物IPS-1在生产IFN-Ⅰ和促炎性细胞因子中起重要作用，统计分析显示基因型为3741TT的比基因型-3741CC的对GCRV的抵抗力要强。Wan Quanyuan等[13]做了关于LGP2基因的研究，在RNA病毒感染的先天性免疫中LGP2是实用的检测物和调节物，试验表明LGP2不同的基因型与对GCRV的抵抗力(易感性)有密切相关，-1392GG基因型比CC基因型对GCRV更敏感，494TT基因型和4403TT基因型比AA和CC对GCRV更有抵抗力。Wang等报道MDA5是RLR家族的成员，在应对病毒感染的先天性免疫中起重要作用，试验结果表明基因型-713C/G和3338A/C与对GCRV的抵抗力关系密切，-713G和3338C对GCRV有抵抗力。Wan Quanyuan等[14]发现了一个RIG-Ⅰ编码区缺失的突变基因，它与对GCRV的抵抗力(易感性)有关，对照试验表明经GCRV攻毒后有缺失突变的组累积死亡率更高。这些结果表明草鱼体内的某些基因对抗草鱼呼肠病毒有帮助。若能选育出抗GCRV的草鱼品种，将会对草鱼出血病的防治提供极大的帮助。

4　GCRV检测方法

目前针对草鱼呼肠病毒建立了很多检测方法，为疾病的快速准确诊断、流行病学的调查以及疾病的防治打下了基础。这些检测方法大致可分为以下四类：

常规PCR检测方法，实现了从单重到多重的检测。2010年，Zhang等以S10基因片段为模板，用先进的RNA提取技术建立RT-PCR检测方法，515 bp的S10片段dsRNA能检出的最低值是1.0 fg，该技术能用于GCRV和其他dsRNA的快速诊断。2011年，Chi等建立了双重PCR检测方法，根据GCRV-GD108株的11个节段序列和GCRV标准株分别设计引物，筛选出适合的引物对，该方法能在一次反应中鉴别出病毒属GCRV或GCRV-GD108株，可以提高检测效率同时节约成本。2012年，王晓丰等根据GenBank中GCRV VP6蛋白基因保守序列设计引物，以GCHV-892总RNA为模板，通过RT-PCR反应扩增出目的条带，并对该方法能检测的最低浓度是102拷贝数/μL，方法特异性良好。2012年，曾伟伟等[5]建立了三重PCR检测方法，根据GCRV各类型毒株的保守区域设计3对引物，该法敏感性、特异性、稳定性良好，且能在一次反应中鉴别毒株所属基因型，鉴别效率比上述双重PCR更高，应用前景更广，是一种能对草鱼出血病进行快速诊断和分子流行病学进行调查的方法。

实时荧光定量PCR(real-time PCR)检测方法提高了灵敏度。 2011年，周勇等用RT-PCR技术扩增出GCRV VP6基因片段，克隆到载体上，构建出重组质粒pEGFP-N1-VP6，作为模板进行TaqMan real-time PCR扩增，制作出标准曲线，该方法灵敏度高，特异性强，同时可进行定量分析，能用于GCRV的快速诊断和定量检测。2011年-2012年期间，刘宝芹等做了两个实时荧光定量PCR研究，一个是根据GCRV HZ08株S7基因保守序列设计引物和探针，用含有 S7 基因全长的重组质粒 PAVX1-S7 作为标准品，构建出标准曲线，比常规PCR方法更能检测出草鱼出血病；另一个研究是根据GCRV JX-0901株S7基因保守序列设计引物和探针，构建出标准曲线，试验表明该方法有较好的敏感性和特异性。2013年，殷亮等[15]根据基因Ⅰ型GCRV S6保守序列设计引物和探针，并构建含PVAX1-S6片段的标准质粒，制作出标准曲线，该方法灵敏、高效、特异、可重复性强，适用于GCRV基因Ⅰ型的快速检测和定量分析。2013年，杨映等[16]建立了实时荧光定量RT-PCR检测方法，根据传统毒株GCRV-873的S6基因序列和新型毒株GCRV GD-108的L2基因序列设计引物，从多对中筛选出两对合适的引物，该方法灵敏度达10拷贝数/μL，特异性、重复性、稳定性比普通PCR更好，且一次反应就能鉴别出新型GCRV和传统型GCRV,可用于草鱼呼肠病毒的早期诊断和流行病学调查。

反转录-环介导等温扩增技术(RT-LAMP)检测方法可在基层应用。2013年，Zeng W W等[17]根据GCRV-HZ08 S6基因片段保守序列设计了6个RT-LAMP引物，结果可通过荧光染料显色直接观测，能检出最低10拷贝数/μL的量，特异性良好，能简单快速的检测GCRV HZ08基因型的感染。2012年，张金凤等[18]根据GCRV VP6基因序列设计引物，以病毒全基因组RNA为模板，该方法使用SYBR Green Ⅰ荧光染料，结果易判定且灵敏度达33 pg，且能简捷快速的检测和诊断草鱼出血病。2012年，王晓丰等根据GenBank中GCRV HZ08等毒株的VP6蛋白基因序列设计引物，以GCRV-892总RNA为模板，该方法的敏感度达10拷贝数/μL，适用于和GCRV HZ08属同一基因型的病毒检测。2012年，李玉平等根据GCRV VP6基因序列设计引物，以样品cDNA为模板，用SYBR Green Ⅰ作染料，能通过肉眼观察来判定结果，该方法适用于水产养殖临床上对GCRV快速诊断。2013年，杨水仙等[19]根据GenBank登录号为AF236688的VP7基因保守区设计引物，验证筛选出RT-LAMP特异性引物，该方法准确性高，所需条件易满足，检测方法简单，能直接判定结果，可用于基层实验室和现场检测。

2013年，He Yongxing等[20]根据草鱼IgM的保守序列制备和筛选出单克隆抗体，建立了一种特异性针对GCRV VP7蛋白抗体的蛋白印迹法，该法能用于GCRV感染的血清学诊断。2014年，Jing Hongli等[21]建立了单克隆抗体检测GCRV的方法，用组氨酸标签对重组的VP4进行重构并在E.coli中大量表达，该方法针对重组的VP4蛋白获得了4种单克隆抗体 ，特异性和敏感性好，能用于GCRV的准确诊断。

5　草鱼出血病的防控

目前草鱼出血病的防控大致可分为疫苗预防免疫、抗病毒药物防治和土法防控三类，以疫苗免疫为主。

5.1疫苗防控

生产上用得较多的是组织灭活疫苗和减毒活疫苗，亚单位疫苗和基因疫苗还没有在生产上推广使用。陈道印等报道用渔场出血病病料制作的毒种疫苗，又用于本渔场的草鱼接种，保护率达98.03%，能有效的防控草鱼出血病；胡光安报道珠江水产研究所研制的草鱼出血病冻干细胞弱毒疫苗，免疫保护率达90%以上，有免疫原性强、免疫效果好、免疫保护期长等优点；林明辉等报道用草鱼出血病冻干细胞疫苗(防治病毒性出血病)与细菌性“三联”灭活疫苗(防治细菌性烂鳃病、肠炎病、赤皮病)肌肉注射草鱼，与对照组相比，免疫效果显著，可有效防治草鱼四病的发生，是提高养殖效益的有效措施；刘林等构建了将GCRV VP6基因克隆进载体杆状病毒的核酸疫苗，免疫试验表明此核酸疫苗具有较好的免疫保护效果。Tian Yuanyuan等[22]报道了在GCRV-GD108 VP4上有多个B细胞抗原决定簇，用原核载体pET32a在E.coliBL21(DE3)株中表达VP4重组蛋白，试验结果表明此亚单位疫苗可用来对GCRV-GD108株进行免疫；邹勇构建了含GCRV外衣壳蛋白VP6基因的重组基因疫苗，以氢氧化铝佐剂为免疫增强剂，设置浓度梯度和对照试验，结果显示此疫苗能够诱导草鱼产生免疫反应，有很高的免疫保护率。 亚单位疫苗和基因疫苗有较好的免疫效果，但是技术含量高，成本也很高，制备过程复杂，目前没能得到推广应用。接种草鱼出血病冻干细胞弱毒疫苗是一种比较有效的免疫方法，但弱毒苗有复壮的风险，在使用过程中需小心。

5.2抗病毒药物防控及土法防控

除了主流的以注射疫苗免疫的防控方法外，还有一些其他的防控手段，使用抗生素和中草药是最常见的手段。例如投喂“三黄粉”，用水花生、大蒜头和盐拌饵投喂，大黄、黄芩、黄柏、板蓝根拌饲投喂；金处方药剂的外消和内服，投喂枫香树叶、大黄硫酸铜合剂浸洗病鱼或全池泼洒以及菜油煮沸后冷却与经煮沸后的大黄混匀全池泼洒等方法；郭慧玲报道了用金银花、菊花、大黄、黄柏研碎混匀加水全池泼洒等方法；兰作友报道用生石灰，病毒灵(黄芪多糖)、诺氟沙星、板兰根，适当添加维生素，维生素C治疗8 d，能起到很好的效果；张忙友报道使用晋鑫底净、止血康鳃、菌毒清、胰肾病毒康、败毒散、止痢停、10%恩诺沙星粉、高稳维生素 CAE治疗，7 d后草鱼停止死亡。

免疫途径有口服、浸泡和注射这几种，经口服投食饲喂的方式要经过胃肠道的消化吸收，免疫效果会被削弱；浸泡免疫要通过机体屏障，免疫效果也不理想；这两种方法的优点是省时省力。注射法的免疫效果好，但鱼个体小，数量多，操作起来繁琐复杂，对于渔场来说工作量非常大，而且注射也可能对鱼造成机体伤害。技术的进步带来口服法和浸泡法的改进。李瑞伟等[23]报道了GCHV细胞培养灭活疫苗的微囊化技术，能降低疫苗抗原的损失，以海藻酸钠、壳聚糖为微囊壁材，以灭活疫苗为微囊芯材，制备成微囊疫苗，试验与疫苗口服组、对照组做了比较，结果显示微囊疫苗有62.5%的相对免疫保护力。Xue Renyu等[24]报道了一种以蚕蛹做口服疫苗的方法，构建了一个含2个GCRV VP6基因的载体pFastBac-FA-VP6-ph-VP6，重组杆状病毒BacFish-vp6，用以饲喂5龄蚕，5 d后用蚕的冻干粉末作口服疫苗，结果显示这种口服疫苗是有效的。刘秋凤等[25]做了GCRV为载体培养技术与灭活疫苗浸泡免疫效果研究，试验优化了CIK细胞在微载体Cephodex上的培养条件，并在此微载体的CIK细胞上培养GCRV病毒，然后制备灭活疫苗并用浸泡法免疫草鱼，结果显示浸泡免疫后增强了机体的免疫保护力。

草鱼出血病病原主要侵染在草鱼的活组织细胞中而致病。采用化学药物治疗则因为药物很难渗入到病毒所感染的组织细胞或渗入的含量很低而达不到杀灭病毒的药量，所以很难达到疗效。采用免疫法来提高草鱼自身对出血病病毒的抵抗能力，以防控草鱼出血病的发生,是非常有效的防治途径。

6　展望

当前，防治草鱼出血病的最为有效的办法仍然是疫苗免疫，但疫苗使用过程中，问题也比较多，目前获得法规许可的疫苗产品仅有一种，通过连续传代致弱的活疫苗，而且未获得大规模的推广应用和认可，主要原因其一是安全性问题，因为通过连续传代致弱的毒株，可能在感染敏感宿主之后，又毒力返强了；其二是弱毒疫苗不适合在气温比较高的时候应用；其三是价格还比较贵。通过多来源、多途径的方式开发研制低毒、高效、速效的新型免疫增强剂已成为草鱼出血病防治研究的主要趋势，而随着对草鱼免疫机制的更深入、更全面的研究,口服型免疫增强剂将会成为控制草鱼出血病、提高草鱼免疫力极为有效的途径。

能同时检测和鉴别所有草鱼呼肠病毒株型标准诊断方法的建立，做好鱼苗苗种病原检测，确保放养的草鱼鱼苗不携带病毒，是降低和控制草鱼出血病流行与爆发的重要措施。疫苗免疫仍然是今后草鱼出血病防控最为重要的手段，根据草鱼出血病流行病学调查结果，研制针对当前草鱼出血病流行株型的多价或单价灭活疫苗和新一代弱毒活疫苗是当前草鱼出血病防控最为紧要的事情；亚单位疫苗、DNA疫苗等基因工程新型疫苗的研制，是今后草鱼出血病疫苗发展的方向；草鱼出血病疫苗的免疫途径仍然是以注射为主，这种免疫方式比较繁琐，而且费时费力，也增加了疫苗的应用成本，提高口服疫苗和浸泡疫苗免疫效果是今后草鱼出血病疫苗研究的重要方向。

虽然对草鱼呼肠病毒进行了多方面的研究，但是草鱼出血病的防控形势依然严峻，每年该病的爆发依然对渔业生产造成巨大损失，通过疫苗免疫的手法有一定效果但不能完全防控该病。对草鱼呼肠病毒进行研究，从分子生物学、宿主对病毒的敏感性和病毒的交叉免疫保护效果方面开展研究，以期能对该病的防控做出更多的贡献。

参考文献:

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收稿日期：2015-11-07

基金项目：江西省科技计划项目(20152ACF60021)；国家科技支撑计划项目(2012BAD25B02)

作者简介：李贤(1989-)，男，湖南邵阳人，硕士研究生，主要从事水产动物病害研究。*通讯作者

中图分类号:S941.41

文献标识码:A

文章编号:1007-5038(2016)07-0094-08

Progress on Grass Carp Reovirus

LI Xian1,2，ZENG Wei-wei1，WANG Qing1，WANG Ying-ying1，LI Ying-ying1，SHI Cun-bin1，WU Shu-qin1

(1．PearlRiverFisheryResearchInstitute,ChineseAcademyofFisherySciences,KeyLaboratoryofFisheryDrugDevelopment,MinistryofAgriculture,KeyLaboratoryofAquaticAnimalImmuneTechnology,KeyLaboratoryofFisheryDrugDevelopment，MinistryofAgriculture，Guangzhou，Guangdong，510380，China；2．CollegeofFisheriesandLifeScience，ShanghaiOceanUniversity，Shanghai，201306，China)

Abstract:Grass carp hemorrhage caused by grass carp reovirus,is a highly contagious and fatal viral disease，frequent outbreaks of the disease cause huge economic losses to our grass carp and freshwater aquaculture.In this paper，grass carp reovirus genome sequence and genotyping，epidemiology，innate immunity，detection methods，immune prevention research progress in these areas in recent years were reviewed,in order to provide reference for the grass carp reovirus studies，and prevention and control of grass carp hemorrhage.

Key words:Grass carp reovirus; genome; epidemiology; innate immunity; detection method