拉米夫定胶囊和片剂在健康人体内的药动学和生物等效性研究Δ

赵明明，李国飞，邱　枫，孙亚欣，肇丽梅

(中国医科大学附属盛京医院药学部临床药理研究室，辽宁 沈阳110004)



拉米夫定胶囊和片剂在健康人体内的药动学和生物等效性研究Δ

赵明明*，李国飞，邱枫，孙亚欣，肇丽梅#

(中国医科大学附属盛京医院药学部临床药理研究室，辽宁 沈阳110004)

目的：建立测定人血浆中拉米夫定含量的液相色谱串联质谱法(liquid chromatography tandem mass spectrometry，LC-MS/MS)，并评价拉米夫定胶囊和片剂在健康人体内的药动学过程和生物等效性。方法：24名健康志愿者随机双交叉单剂量口服100 mg拉米夫定胶囊和片剂，采用LC-MS/MS法测定血浆中药物浓度，利用DAS 3.0软件计算药动学参数和生物利用度，并进行生物等效性评价。结果：单剂量口服拉米夫定胶囊和片剂后，达峰时间(Tmax)分别为(1.05±0.43)和(1.01±0.38) h，药峰浓度(Cmax)分别为(979.05±267.25)和(1 023.59±340.14) ng/ml，半衰期(t1/2)分别为(9.55±4.64)和(8.95±4.68) h，药-时曲线下面积(AUC0～t)分别为(3 799.15±1 103.26)和(3 727.14±1 083.10) ng·h/ml；AUC0～∞分别为(3 881.94±1 135.72)和(3 811.56±1 103.61) ng·h/ml。拉米夫定胶囊AUC0～t、AUC0～∞和Cmax的90%置信区间分别为拉米夫定片的95.4%～109.8%、95.3%～109.5%和86.1%～109.1%，拉米夫定胶囊的相对生物利用度为(104.8±25.8)%。结论：该方法可用于拉米夫定药动学和生物等效性研究，本研究中国产拉米夫定胶囊与片剂生物等效。

拉米夫定； 药动学； 生物等效性； LC-MS/MS

拉米夫定为核苷类抗病毒药，在乙型肝炎病毒感染细胞和正常细胞细代谢为拉米夫定三磷酸盐，其为拉米夫定的活性形式，主要作为病毒逆转录时的链终止物，从而实现对病毒的抑制作用。同时，拉米夫定疗效确切，与其他核苷类逆转录酶抑制剂相比，不良反应少、毒性低，是目前临床上使用最好的抗乙型肝炎病毒药之一[1-2]。拉米夫定片(规格：每片含拉米夫定100 mg)适用于伴有丙氨酸氨基转移酶升高和病毒活动复制的肝功能代偿的慢性乙型病毒性肝炎患者[3]。文献报道，口服拉米夫定100 mg后，药峰浓度(Cmax)约为1.1～1.5 mg/ml[4]。因此，研究拉米夫定胶囊(规格：每粒含拉米夫定100 mg)的药动学和生物等效性行为，需要生物样品的分析方法具备较高的灵敏度。文献报道，对拉米夫定的血药浓度测定多采用高效液相色谱法[5-6]，此法检测灵敏度较低，耗时过长。本研究建立了利用液相色谱串联质谱法(liquid chromatography tandem mass spectrometry，LC-MS/MS)测定人血浆中拉米夫定含量的方法，采用液液萃取法进行血样处理，专属性强，灵敏度高，为研究拉米夫定胶囊和片剂在健康人体的药动学和生物等效性提供了可靠保证，为该药的临床应用提供了参考依据。

1　材料

1.1仪器

AB QTRAP 4500型三重四级杆串联质谱仪(美国Applied Biosystem Sciex公司)；Agilent 1290系列高效液相色谱系统(美国Agilent公司)；TARGIN VX-Ⅱ型多管涡旋振荡器(北京踏锦科技有限公司)；TurboVap LV型全自动样品浓缩仪(美国Biotage公司)；TDL-40C型低速台式离心机(上海安亭科学仪器厂)。

1.2药品与试剂

拉米夫定工作对照品(由东北制药集团沈阳第一制药有限公司提供，含量：99.7%，批号：101007-200701)；苯海拉明对照品(由中国药品生物制品检定所提供，含量：≥98%，批号：100066-199705)；甲酸(Sigma公司)；异丙醇和二氯甲烷(国药集团化学试剂有限公司)；甲醇和乙腈为色谱纯，空白人血浆由中国医科大学附属盛京医院输血科提供。受试制剂(T)：拉米夫定胶囊(东北制药集团沈阳第一制药有限公司，规格：每粒含拉米夫定100 mg，批号：8140503)；参比制剂(R)：拉米夫定片(葛兰素史克制药有限公司，规格：每片含拉米夫定100 mg，批号：13060063)。

1.3研究对象

经中国医科大学附属盛京医院医学伦理委员会批准，选择24名男性健康志愿者，并签署知情同意书。24名志愿者平均年龄(26.2±3.1)岁，平均体质量(67.7±6.0) kg，平均身高(1.73±0.04) m。

2　方法与结果

2.1试验设计与血样采集

本试验采用自身前后对比两制剂双周期随机交叉试验设计，24名受试者随机分为2组，每组12人。每名受试者随机先后单次口服受试制剂1粒(相当于拉米夫定100 mg)或参比制剂1片(相当于拉米夫定100 mg)。给药前1日晚，入选的受试者入住Ⅰ期临床试验病房，禁食、不禁水过夜；试验日清晨，所有受试者分别空腹口服1粒受试制剂或1片参比制剂。服药前(0 h)和服药0.33、0.67、1.00、1.50、2.00、3.00、4.00、6.00、8.00、10.00、12.00、24.00、36.00、48.00 h后于上肢肘窝静脉取血4 ml，收集于肝素抗凝的试管中，混匀后离心10 min(转速=3 500 r/min)，分离血浆，置于-20 ℃ 冰箱储存待用。

2.2测定方法和血浆样品处理

2.2.1色谱与质谱条件：色谱柱为Agilent Eclipse XDB C18柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流动相为甲醇-水(0.1%甲酸)(V∶V=70 ∶30)；流速为0.6 ml/min；柱温为40 ℃；进样量为2 μl。电喷雾离子化源；ESI正离子电离方式；扫描方式为质谱多反应监测(multiple reaction monitoring，MRM)，离子喷射电压为5 500 V；温度为500 ℃；源内气体1(GS1，N2)压力为50 psi(1 psi=6.895 kPa)，气体2(GS2，N2)压力为60 psi；气帘气体(N2)压力为10 psi；拉米夫定用于定量分析的离子反应为质荷比(m/z)229.9→111.9[去簇电压(declustering potential，DP)为35 V，碰撞能量(collision energy，CE)为20 eV]；内标苯海拉明的离子反应为m/z256.1→166.6[DP为30 V，CE为40 eV]，相应的二级全扫描质谱图见图1。

A.拉米夫定；B.苯海拉明(内标)A.Lamivudine；B.Diphenhydramine(interior label)图1　拉米夫定[M+H]+和内标苯海拉明[M+H]+的产物离子扫描质谱图Fig 1　Product ion spectra of [M+H]+ of lamivudine and diphenhydramine

2.2.2血浆样品处理：精密吸取血浆样品200 μl置于7 ml离心管中，加入内标溶液40 μl，甲醇20 μl，涡旋1 min，混合均匀，然后加入提取溶剂异丙醇-二氯甲烷(V∶V=1 ∶1)4 ml，涡旋10 min，离心10 min(转速=3 500 r/min)，取上清液于40 ℃水浴氮气流下吹干，然后加甲醇-水(V∶V=80 ∶20)1 ml，涡旋5 min，复溶，离心5 min(转速=16 000 r/min)，取上清液2 μl进样分析。

2.3方法学考察

2.3.1标准溶液配制：精密称取拉米夫定对照品2.50 mg，置于25 ml容量瓶中，加水溶解并定容，配制成100 μg/ml的拉米夫定储备液。取拉米夫定储备液适量，用甲醇分别稀释成浓度为50、100、500、1 000、2 000、5 000、10 000和20 000 ng/ml的拉米夫定标准系列溶液，同时，另外配制100、1 000和16 000 ng/ml的质量控制(quality control，QC)溶液，于4 ℃冷藏备用。此外，精密称取1.003 mg苯海拉明对照品，置于10 ml容量瓶中，加甲醇溶解并定容，配制成质量浓度为100.3 μg/ml苯海拉明的储备液，取苯海拉明储备液适量，用甲醇稀释成500 ng/ml溶液作为内标溶液使用。

2.3.2专属性考察：分别取6名受试者的空白血浆200 μl，除不加入内标溶液并另外补加甲醇20 μl外，其余按“2.2.2血浆样品的处理”项下方法操作，获得空白血浆样品的色谱图，见图2(A)；将一定浓度的拉米夫定标准溶液和内标溶液加入空白血浆中，依同法操作，得图2(B)；取健康受试者给药后血浆样品，依同法操作，得图2(C)。结果显示，在此色谱质谱条件下拉米夫定和内标苯海拉明的保留时间分别为2.19和2.36 min，峰形良好，血浆中的内源性物质不干扰药物和内标的测定。

2.3.3标准曲线制备与定量下限：精密量取200 μl空白血浆，分别加入拉米夫定标准系列溶液20 μl，配制成相当于血浆浓度为5、10、50、100、200、500、1 000和2 000 ng/ml的血浆样品，除不加甲醇20 μl外，其余按“2.2.2血浆样品的处理”项下操作，进行分析，记录色谱图。以拉米夫定浓度为横坐标，拉米夫定与内标的峰面积比值为纵坐标，用加权(W=1/x2)最小二乘法进行回归运算，求得直线回归方程为As/Ai=0.011 2 C+0.008 8(r=0.999 3)。可见，血浆中拉米夫定的质量浓度在5～2 000 ng/ml范围时，线性关系良好，并且定量下限为5 ng/ml。

2.3.4精密度与提取回收率：制备拉米夫定低、中、高3个质量浓度(10、100、1 600 ng/ml)的QC样品，每质量浓度各6个样本，连续测定3 d。根据当日的随行标准曲线，计算QC样品的测得质量浓度，进而计算所建立方法的准确度与精密度，结果见表1。同时，另取空白血浆200 μl，按“2.2.2血浆样品的处理”项下操作，向提取后的上清液中加入相对应质量浓度的QC溶液和内标溶液，涡旋混合，经氮气吹干复溶后取2 μl进样分析，获得相应峰面积(4次测定的平均值)，以每一质量浓度2种处理方法的峰面积比值计算提取回收率，结果见表1。结果显示，药物和内标提取回收率稳定，结果精密可重现。

2.3.5基质效应：取空白血浆200 μl，除不加内标溶液和甲醇20 μl外，按“2.2.2血浆样品的处理”项下操作，向提取后的上清液中加入对应浓度的QC和内标溶液，涡旋混合后，经氮气吹干复溶，取2 μl进行LC/MS/MS分析，获得相应峰面积。同时，另取水200 μl，同法操作，得到相应峰面积(4次测定的平均值)。以含有基质的样品的峰面积与纯水提取获得的色谱图峰面积之比作为指标，考察样品低、中、高3个质量浓度的基质效应。结果显示，拉米夫定低、中、高3个质量浓度的基质效应分别为(98.46±1.25)%、(94.55±2.20)%、(90.03±1.93)%，内标苯海拉明基质效应为(95.35±3.35)%，表明血浆中基质不影响拉米夫定的测定，能够满足分析测定基本要求。

2.3.6稳定性试验：取拉米夫定低、中、高3个质量浓度(10、100、1 600 ng/ml)的QC样品，每质量浓度3个样本，分别考察室温(15～25 ℃)条件下放置4 h，提取后室温(15～25 ℃)条件下放置4 h，以及-20 ℃反复冻融循环3次和-20 ℃冷冻放置1个月的稳定性。结果显示，在上述条件下，拉米夫定和内标均有很好的稳定性，所有样品测定质量浓度的相对误差均<(±15%)。

2.4数据分析

根据血药浓度数据，采用DAS 3.0软件，根据统计矩原理，计算药动学参数，并评价拉米夫定胶囊和片剂的生物等效性。

2.5血药浓度-时间曲线和药动学参数

24名健康受试者口服100 mg拉米夫定胶囊或拉米夫定片后，用所建立的LC-MS/MS法进行血药浓度测定，得到不同时间的拉米夫定平均血药浓度-时间曲线，见图3，主要药动学参数见表2。

图3　24名受试者口服受试制剂(T)和参比制剂(R)后拉米夫定的平均血药浓度-时间曲线Fig 3　Mean plasma concentration-time profile of lamivudine after oral administration of test(T) and reference preparations(R) in 24 healthy volunteers

参数受试胶囊参比片剂半衰期(t1/2)/h9.55±4.648.95±4.68Cmax/(ng/ml)979.05±267.251023.59±340.14达峰时间(Tmax)/h1.05±0.431.01±0.38药-时曲线下面积(AUC0～t)/(ng·h/ml)3799.15±1103.263727.14±1083.10AUC0～∞/(ng·h/ml)3881.94±1135.723811.56±1103.61

2.6生物等效性分析

将拉米夫定主要药动学参数AUC0～t、AUC0～∞和Cmax经对数转换后用多因素方差分析进行显著性检验，分析药物间、个体间及周期间的变异。并利用双单侧t检验和(1～2α)置信区间法评价2种制剂间的生物等效性。统计结果显示，拉米夫定胶囊和片剂在健康人体内的主要药动学参数的差异无统计学意义(P>0.05)。经双单侧t检验，拉米夫定胶囊AUC0～t、AUC0～∞和Cmax的90%置信区间分别为相应片剂参数的95.4%～109.8%、95.3%～109.5%和86.1%～109.1%，2种制剂Tmax的差异无统计学意义(P>0.05)，即2种制剂具有生物等效性。拉米夫定胶囊相对于进口片剂的生物利用度为(104.8±25.8)%。

3　讨论

虽然国内外已有拉米夫定血药浓度测定方法的报道，但这些方法或采用高效液相色谱法[5-6]，灵敏度低，分析时间较长；或样品处理时选择固相萃取法，操作复杂，成本昂贵[4]；或采用液质联用方法，但分析时间过长，每个样品耗时8 min[7]。本研究所建立的测定人血浆中拉米夫定浓度的LC-MS/MS法，样品处理采用液液萃取法，不仅简化了样品制备的过程，还排除了血浆中强极性杂质的干扰，专属性高；此外，所建立的方法具有较高的灵敏度，定量下限为5 ng/ml，整个样品分析用时较短，仅为3.5 min，适用于大批量样品的快速分析测试，并且经方法学考察发现各项分析指标都满足生物样本分析方法的要求。

因此，本研究所建立的方法简单、快速、灵敏度高、专属性强、重现性好，可用于拉米夫定药动学和生物等效性研究。本研究结果显示，24名男性志愿者单次口服100 mg拉米夫定胶囊和片剂后，其药动学参数与文献报道相仿[8-9]，2种制剂主要药动学参数变化的差异无统计学意义，并且拉米夫定胶囊相对片剂的AUC0～t、AUC0～∞和Cmax的90%置信区间符合生物等效要求的范围，试验制剂与参比制剂生物等效，提示本研究的国产拉米夫定胶囊与进口片剂在吸收的程度与速度上无显著差别，具有生物等效性，可在临床替代使用。

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Pharmacokinetics and Bioequivalence of Lamivudine Capsules and Tablets in Healthy VolunteersΔ

ZHAO Mingming, LI Guofei, QIU Feng, SUN Yaxin, ZHAO Limei

(Dept.of Pharmacy, Division of Clinical Pharmacology, Shengjing Hospital Affiliated to China Medical University,Liaoning Shenyang 110004, China)

OBJECTIVE：To establish the LC-MS/MS method for the determination of lamivudine in plasma and to evaluate the pharmacokinetics and bioequivalence of Lamivudine capsules and tablets in healthy volunteers. METHODS: A single oral dose (100 mg of Lamivudine capsules and tablets) was given to 24 healthy volunteers in a randomized crossover study. The plasma concentration of lamivudine was determined by LC-MS/MS method. The pharmacokinetic parameters were calculated and the bioequivalence of the two formulations were evaluated by DAS 3.0 program. RESULTS: After a single dose, the pharmacokinetic parameters of Lamivudine capsules and tablets were as follows:Tmax：(1.05±0.43) h and (1.01±0.38) h;Cmax：(979.05±267.25) ng/ml and (1 023.59±340.14) ng/ml;t1/2：(9.55±4.64) h and (8.95±4.68) h;AUC0-t：(3 799.15±1 103.26) ng·h/ml and (3 727.14±1 083.10) ng·h/ml；AUC0-∞：(3 881.94±1 135.72) ng·h/ml and (3 811.56±1 103.61) ng·h/ml respectively.The 90% confidential interval ofAUC0-t,AUC0-∞andCmaxwas 95.4%-109.8 %, 95.3%-109.5% and 86.1%-109.1%, respectively. The relative bioavailability of Lamivudine capsules and tablets was(104.8±25.8)%. CONCLUSIONS: The method can be used in the pharmacokinetics and bioequivalence of Lamivudine capsules and tablets, and the two preparations were bioequivalent.

Lamivudine; Pharmacokinetics; Bioequivalence; LC-MS/MS

2016-06-03)

“重大新药创制”科技重大专项十二五第二批项目(No.2012ZX09303015)

教授，博士生导师。研究方向：临床药学和临床药理学。E-mail：zhaolm@sj-hospital.org

R969；R978.7

A

1672-2124(2016)07-0874-04

10.14009/j.issn.1672-2124.2016.07.004

*药师，硕士。研究方向：临床药理学。E-mail：zhaomingming1127@163.com