知百安神口服液的质量标准改进研究Δ

夏天一，张　凤，李志文，庞　涛，李静娴，朴淑娟，陈万生，邬　蓉

(第二军医大学附属长征医院药材科，上海200003)



·论著·

知百安神口服液的质量标准改进研究Δ

夏天一*，张凤，李志文，庞涛，李静娴，朴淑娟，陈万生，邬蓉#

(第二军医大学附属长征医院药材科，上海200003)

目的：提升知百安神口服液的质量标准。方法：采用薄层色谱法分别对知母和百合进行定性鉴别，采用高效液相色谱法对知母新芒果苷、芒果苷进行定量检测。色谱柱为Agilent Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流动相为乙腈-0.2%甲酸水溶液，采用梯度洗脱，流速为1 ml/min，检测波长为246 nm，柱温为30 ℃，进样量为20 μl。结果：薄层鉴别色谱中斑点特征明显、专属性好。新芒果苷、芒果苷的质量浓度线性范围分别为10.5～210.0、10.4～208.0 μg/ml(r2均≥0.999 9)，精密度、重复性、稳定性试验的RSD均<2.00%。平均加样回收率分别为103.49% (RSD=0.86%)、98.81% (RSD=1.26%)(n=6)。结论：该方法简便可靠，可用于提升知百安神口服液的质量控制。

薄层色谱法； 高效液相色谱法； 知百安神口服液； 质量标准

知百安神口服液为第二军医大学附属长征医院(以下简称“我院”)自主研发的医院制剂，为中药知母与百合经加工炮制而得。原方始见于汉代张仲景的《金匮要略》，由百合7枚、知母3两组成，具有清热养阴、除烦润燥的功效[1]，临床上可用于以抑郁、烦躁不安、失眠、疲乏、烘热等为主症的围绝经期综合征的治疗[2-4]。现代药理学研究结果表明，知母中黄酮类活性成分能抑制Na+-K+-ATP酶的活性，减少组织耗氧量，并具有抗肿瘤、抗氧化、抗衰老等药理活性[5-7]。目前主要通过对知母中黄酮类主要成分新芒果苷与芒果苷进行含量测定以及对知母进行薄层色谱法(thin layer chromatography，TLC)鉴别，实现知母百合药的质量控制，但鲜有文献提及百合的特异性TLC鉴别[8-10]。因此，为提升知百安神口服液的质量标准，确保用药安全、有效，本研究同时对知母与百合进行了TLC鉴别，并采用高效液相色谱法(high performance liquid chroma-tography，HPLC)测定了口服液中新芒果苷与芒果苷的含量。

1　材料

1.1仪器

Agilent 1200系列HPLC仪(美国Agilent公司)；CPA225D型十万分之一电子天平(德国Sartorius公司)；SK7200H型超声仪(上海科导超声仪器有限公司；功率：350 W，频率：53 kHz)。

1.2药品与试剂

知百安神口服液(我院自制，批号：120208、130323、140327)；新芒果苷对照品(大连美仑生物技术有限公司，批号：MB6977，纯度>98%)、芒果苷对照品(大连美仑生物技术有限公司，批号：MB6776，纯度>98%)；甲醇、乙腈、二氯甲烷(德国默克公司，色谱纯)；甲酸(美国天地公司，色谱纯)；乙醚、丙酮、正丁醇、冰醋酸、硫酸、乙酸乙酯(国药集团化学试剂有限公司，分析纯)；香草醛(广东光华科技股份有限公司，纯度>98%)；百合药材(产自湖南)，知母药材(产自河北)；水为超纯水。

2　方法与结果

2.1薄层鉴别

2.1.1知母：取本品10 ml，加热回流1 h，浓缩至约2 ml，加30%丙酮3 ml，混匀，作为供试品溶液。另取知母药材1 g，加入30%丙酮30 ml超声30 min，滤过，将滤液浓缩至1 ml，制成对照药材溶液。另取缺知母的阴性样品，按供试品溶液制备方法操作，制得阴性对照溶液。按照《中华人民共和国药典：四部》(2015年版)TLC试验[11]，吸取上述3种溶液各10 μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正丁醇-冰醋酸-水(V∶V∶V=4 ∶1 ∶5)上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1%香草醛硫酸溶液，在105 ℃显色至斑点清晰。供试品色谱中，在与对照药材溶液色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性对照药材色谱无相应斑点，见图1。

1～3.供试品溶液(1.批号：120208；2.批号：130123；3.批号：140327)；4.知母对照药材溶液；5.缺知母阴性对照溶液1-3.Test sample solution (1.Batch: 120208 2.Batch: 130123; 3.Batch: 140327); 4.Solution of anemarrhenae rhizome;5.Negative control without anemarrhenae rhizoma图1　知母的薄层色谱图Fig 1　TLC chromatogram of anemarrhenae rhizoma

2.1.2百合：取本品10 ml，用15 ml水饱和的正丁醇萃取，将上层萃取液挥干，用2 ml丙酮超声溶解，滤过，作为供试品溶液。另取百合药材1 g，加入30 ml甲醇超声30 min，滤过，将滤液浓缩至1 ml，制成对照药材溶液。另取缺百合的阴性样品，按供试品溶液制备方法操作，制得阴性对照溶液。按照TLC试验，吸取上述3种溶液各10 μl，分别点于同一TLC Silica gel 60 RP-18 反向键合薄层层析板上，以丙酮-水(V∶V=1 ∶1，每10 ml展开剂中加入2滴甲酸)为展开剂，展开，取出，晾干，在254 nm紫外光下检视。供试品色谱中，在与对照药材溶液色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性对照药材色谱无相应斑点，见图2。

1～3.供试品溶液(1.批号：120208；2.批号：130123；3.批号：140327)；4.百合对照药材溶液；5.缺百合阴性对照溶液1-3. Test sample solution (1.Batch: 120208 2.Batch: 130123; 3.Batch: 140327); 4. Solution of lilii bulbus; 5.Negative control without lilii bulbus图2　百合的薄层色谱图Fig 2　TLC chromatogram of Lilii bulbus

2.2含量测定

2.2.1色谱条件与系统适用性试验：色谱柱为Agilent Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm，5μm)；流动相为乙腈(A)-0.2%甲酸酸水溶液(B)，梯度洗脱，洗脱程序详见表1；流速为1 ml/min；柱温为30 ℃；检测波长为246 nm；进样量为20 μl。按上述条件进样测定，理论塔板数以新芒果苷计算均>20 000，以芒果苷计算均>30 000，待测化合物分离度均>1.5。阴性对照溶液在待测化合物出峰位置处无干扰峰，供试品溶液中待测化合物与其他组分色谱峰能够实现良好分离，见图3。

表1　梯度洗脱程序Tab 1　Gradient elution program

A.混合对照品溶液；B.供试品溶液；C.阴性对照溶液；1.新芒果苷；2.芒果苷A.Mixed reference solution; B.Test sample solution; C.Negative control solution; 1.Neomangiferin; 2.Mangiferin图3　高效液相色谱图Fig 3　HPLC chromatogram

2.2.2混合对照品溶液：精密称取新芒果苷、芒果苷对照品各10.50、10.40 mg，分别置于同一10 ml容量瓶中，加10%甲醇溶解并稀释至刻度，即得。

2.2.3供试品溶液：精密量取知百安神口服液(批号：120208)1 ml，用1 ml二氯甲烷萃取，静置分层，吸取上层水相200 μl，加入10%甲醇200 μl，13 400 r/min转速下离心5 min，即得。

2.2.4阴性对照溶液：按处方工艺制备除知母外的全部药材，按成品工艺及“2.2.3”项下供试品溶液的制备方法制成阴性对照溶液。

2.2.5线性关系考察：分别精密量取“2.2.2”项下混合对照品溶液200、150、100、75、50、20、10 μl，置于1 ml容量瓶中，用10%甲醇定容至刻度，摇匀，制得系列浓度的标准曲线溶液。再按“2.2.1”项下色谱条件依次连续进样测定，平行进样3次，以各成分的峰面积为纵坐标(Y)，质量浓度为横坐标(X，μg/ml)进行线性回归，得新芒果苷、芒果苷线性方程分别为Y=53.92X-26.88(r2=0.999 9)、Y=66.38X-21.67(r2=0.999 9)。结果显示，新芒果苷、芒果苷的质量浓度分别在10.5～210.0、10.4～208.0 μg/ml范围内与各自的峰面积呈良好的线性关系。

2.2.6精密度试验：精密量取吸取“2.2.2”项下混合对照品溶液适量，按“2.2.1”项下色谱条件平行进样6次测定。结果显示，新芒果苷、芒果苷峰面积的RSD分别为0.23%、0.24%，表明仪器精密度良好。

2.2.7稳定性试验：精密量取知百安神口服液(批号：120208)适量，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，分别于放置0、4、8、12、24 h时按“2.2.1”项下色谱条件进样测定。结果显示，新芒果苷、芒果苷峰面积的RSD分别为0.75%、0.72%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.2.8重复性试验：精密量取知百安神口服液(批号：120208)适量，按“2.2.3”项下方法平行制备6份供试品溶液，再按“2.2.1”项下色谱条件进样测定。结果显示，6份供试品溶液中新芒果苷、芒果苷的平均含量分别为190.74、128.58 μg/ml，峰面积的RSD分别为0.89%、1.18%，表明该方法重复性良好。

2.2.9加样回收率试验：精密量取知百安神口服液(批号：120208)6份，每份1 ml，按各成分含量的100%加入新芒果苷、芒果苷，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，计算加样回收率，结果见表2。

2.2.10样品含量测定：精密量取3批知百安神口服液适量，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，再按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，平行进样3次，按外标法计算含量，结果见表3。

表2　加样回收率试验结果(n=6)Tab 2　Results of recovery test (n=6)

表3　样品含量测定结果Tab 3　Content determination results of samples ±s, μg/ml)

3　讨论

3.1TCL鉴别

知百安神口服液中知母与百合的化学成分相似度较高，现有文献中未见百合的特异性TLC鉴别的相关报道[1,12-13]。为完善知百安神口服液的质量标准，本研究增加了百合的TLC鉴别项。对百合进行TLC条件摸索时，参照《中华人民共和国药典》及相关文献[11,14]，采用正向薄层层析板，尝试不同展开剂，供试品溶液均未显示与阴性对照品溶液的特异性差别。最终，通过对百合、知母化学成分进行辨析，选择TLC Silica gel 60 RP-18 反向键合薄层层析板，以丙酮-水(V∶V=1 ∶1，每10 ml展开剂中加入2滴甲酸)为展开剂，实现了百合的TLC鉴别。

3.2提取方法的考察

知百安神口服液系复方知母与百合的水煎液，极性杂质含量较高，增加了待测化合物的分离难度。为降低杂质含量、简化提取条件，本研究选取不同溶剂对口服液进行萃取。在对水饱和正丁醇、二氯甲烷、乙酸乙酯进行萃取效率考察后发现，二氯甲烷的除杂质效果较好，萃取效率较高。最终，本研究选用二氯甲烷作为萃取溶剂。

3.3色谱柱的考察

本研究选用不同厂家的色谱柱，对待测化合物的分离条件进行优化。分别使用Agilent Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)、Dikma Diamonsil C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)和HP-SCX(4.6 mm×250 mm，5 μm)色谱柱，按上述“2.2.1”项色谱条件下分析同一批样品(批号：120208)，结果发现Dikma Diamonsil C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)和HP-SCX(4.6 mm×250 mm，5 μm)色谱柱均不能实现待测化合物(新芒果苷、芒果苷)与邻近杂质色谱峰良好的基线分离，仅Agilent Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色谱柱可以在控制分析时间的基础上实现待测化合物与杂质的有效色谱分离(R>1.5)。最终，本研究选用Agilent Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色谱柱。

综上所述，本方法简便、快速，结果准确可靠，可对医院制剂知百安神口服液进行全面、有效的质量控制。

[1]王金余，孙富增，姚仲青，等.百合知母胶囊的质量标准研究[J].武警医学，2012，23(7)：601-604.

[2]王华富，许惠琴，陈敏敏，等.百合知母汤不同配比对去势围绝经期综合征肾阴虚证大鼠子宫系数及血清性激素的影响[J].中华中医药杂志，2010，25(4)：531-533.

[3]牟艳利.百合知母汤合甘麦大枣汤治疗围绝经期综合征52例[J].实用中医药杂志，2010，26(3)：167.

[4]张颖，赵腾斐，高钦，等.百合知母汤对围绝经期肾虚证大鼠体征及下丘脑单胺类神经递质的影响[J].南京中医药大学学报，2009，25(3)：184-186.

[5]徐爱娟，韩丽萍，蒋琳兰.知母的研究进展[J].中药材，2008，31(4)：624-628.

[6]廖洪利，苏春丽，胡小兰.芒果苷药理研究新进展[J].药学实践杂志，2008，26(3)：161-162.

[7]王华富，蔡宝昌，高钦，等.百合知母汤对自然衰老型围绝经期综合征肾虚证大鼠中枢神经递质含量的影响[J].江西中医学院学报，2009，21(3)：53-55.

[8]方前波，秦昆明，李伟东，等.百合知母汤水煎液总黄酮和总皂苷的含量测定[J].南京中医药大学学报，2010，26(3)：223-225.

[9]陆连英.高效毛细管电泳法测定百合知母汤中芒果苷的含量[J].湖北中医药大学学报，2012，14(4)：25-27.

[10]陈万生，李力，乔传卓.不同产地知母中芒果苷、新芒果苷的含量测定[J].中国中药杂志，2000，25(2)：87-88.

[11]国家药典委员会.中华人民共和国药典：四部[S].北京:中国医药科技出版社,2015:57.

[12]王建军，娄子洋，吴玉田.RP-HPLC同时测定知母中芒果苷和新芒果苷含量[J].中国药学杂志，2004，39(9)：657-658.

[13]秦昆明，方前波，蔡皓，等.百合知母汤及其组方药味的高效液相色谱-电喷雾质谱研究[J].分析化学，2009，37(12)：1759-1764.

[14]王瑞红，刘晓放，张莹，等.蓝芷安脑颗粒的鉴别研究[J].黑龙江医药，2010，23(1)：43-44.

Study on Quality Improvement of Zhibaianshen Oral LiquidΔ

XIA Tianyi, ZHANG Feng, LI Zhiwen, PANG Tao, LI Jingxian, PIAO Shujuan, CHEN Wansheng, WU Rong

(Dept.of Pharmacy, Changzheng Hospital Affiliated to the Second Military Medical University, Shanghai 200003, China)

OBJECTIVE：To improve the quality standard of Zhibaianshen oral lquid. METHODS: Anemarrhenae rhizoma and lilii bulbus were identified by TLC method, and the concentration of neomangiferin and mangiferin were determined by HPLC method. Separation was carried out on a Agilent Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm, 5 μm) column with the mobile phase of acetonitrile and 0.2% formic acid in gradient elution at a flow rate of 1 ml/min. The detection wavelength was set at 246 nm, the column temperature was 30 ℃, and the injection volume was 20 μl. RESULTS: The characteristics of spots in TLC were quite clear with strong specificity. As for neomangiferin and mangiferin, the linear range of the calibration curve was 10.5-210.0 and 10.4-208.0 μg/ml, respectively (r2≥0.999 9), and the results of precision, accuracy and stability were satisfactory withRSDless than 2.00%. The average recovery rate turned out to be 103.49% (RSD=0.86%) and 98.81% (RSD=1.26%) (n=6). CONCLUSIONS: The established method is simple and reliable, which can be used for the quality control of Zhibaianshen oral liquid.

TLC; HPLC; Zhibaianshen oral liquid; Quality standard

2016-03-29)

“重大新药创制”科技重大专项(No.2013ZX09507005)

主管药师。研究方向：医院药学。E-mail：wrkgyl@126.com

R927.11

A

1672-2124(2016)07-0880-04

10.14009/j.issn.1672-2124.2016.07.006

*药师，在读博士研究生。研究方向：药物分析与临床药学。E-mail：yoyosummer31823@126.com