捕食线虫性真菌弯孢节丛孢的分离与鉴定

韩　元，刘　伟，孙龙杰，彭建伟，蔡葵蒸，徐春兰，陈明月（西北民族大学生命科学与工程学院，甘肃 兰州 730030）

捕食线虫性真菌弯孢节丛孢的分离与鉴定

韩元，刘伟，孙龙杰，彭建伟，蔡葵蒸*，徐春兰，陈明月
（西北民族大学生命科学与工程学院，甘肃 兰州 730030）

目的：通过对捕食线虫性真菌的分离与鉴定为家畜寄生线虫病防治的工作者提供更多候选菌种。方法：采用玻片法、琼脂块法，观察分生孢子和分生孢子梗形状并测其大小，从而进行形态学鉴定。结果：分生孢子无色，长椭圆形，1个分隔。分生孢子梗无色，直立，不分枝，8～11个分隔，顶端形成烛台状分枝，在短而小的齿梗上产生3～12个分生孢子，稀疏，呈头状排列，厚垣孢子黄色，球形或椭圆形，单生或串生，直径14～22 μm，一般在培养20 d后形成。捕食器为粘性网。最终鉴定为弯孢节从孢。

捕食线虫性真菌；分离；鉴定；弯孢节从孢

多年来，家畜胃肠道线虫几乎依赖驱虫药来控制。由于驱虫药的大量使用，寄生虫的抗药性增加、畜体内药物残留和生态环境遭到破坏等诸多问题受到科学家的关注［1］。目前人们在寻找其它的生物防治方法来减少化学驱虫剂的使用。一些畜牧业发达的国家如新西兰、澳大利亚等利用捕食线虫真菌防治动物寄生线虫已经取得了一定的进展［2，3］。有研究表明：为家畜投服少量捕食线虫真菌后，能有效地降低寄生虫的感染强度，减少虫卵数量和减轻脏器病变，达到了生物防治线虫的目的［4］。捕食线虫性真菌可以通过菌丝分化形成具有特殊结构的捕食器官如粘性菌丝、粘性菌网、非收缩性环、收缩性环、粘性分枝、粘性球及冠囊体，同时这些捕食器官有它自身所特有的捕捉行为和捕食机制是研发寄生线虫生物防治制剂的重要资源［5，6］。捕食线虫真菌以粪便为营养基质并在牧场中生存繁衍，很多种类随着动物的采食而又进入肠道，又随粪便排出。因此，从家畜自然粪便中分离的捕食线虫真菌常常具有很强的抗消化特性［7］。本研究主要目的从绵羊粪便中分离弯孢节丛孢（Arthrobotrys musiformis）菌进行形态学的观察与鉴定，为家畜寄生线虫病防治的工作者提供更多的候选菌种。

1　材料与方法

1.1实验材料

1.1.1样品采集从云南省普洱市思茅区刀官寨采集了20份新鲜的绵羊粪便样品。直肠采集或落地半小时内的新鲜粪便，采集15～20 g装入无菌的塑料封口袋，详细记录并编号，样品带回实验室，在接种之前需放在4℃冰箱内备用。

1.1.2培养基及主要染液2%水琼脂（Water Agar，WA）培养基：制作水琼脂培养基先备好凉开水，称取琼脂粉8 g，置于500 ml锥形瓶，加凉开水400 ml，煮沸溶解后，放于121℃高压灭菌20 min，倒于灭菌的玻璃培养皿备用。

NGM（Nematode Growth Medium）培养基：分别称取3 g NaCl、2.5 g蛋白胨、17 g琼脂，加入 1 mol/L K2HPO4-KH2PO4缓冲液 （pH=6.0）25 ml和975 ml蒸馏水，121℃高压灭菌20 min后，分别加入已除菌的1 ml胆固醇溶液（5 mg/ml乙醇）、1 ml 1 mol/L MgSO4和1 ml 1mol/L的CaCl2，混匀后，倒于灭菌的玻璃培养皿备用。

乳酚棉兰染液：苯酚20 g，甘油40 ml，乳酸20 ml，棉兰0.05 g，蒸馏水20 ml，将棉兰溶于蒸馏水中，再加入其他成分，微加热，使其溶解，冷却备用。

1.2试验方法

1.2.1分离中所用的诱饵线虫从胃肠道线虫自然感染的绵羊中分离的蛇形毛圆线虫（Trichostrongylus colubriformis）3期幼虫（L3）保存在4℃冰箱内。为了恢复T.colubriformis L3的活力，对两只三个月龄的绵羊在室内进行人工感染。首先对这两只绵羊进行驱虫，联合使用阿苯达唑15 mg/kg和左旋咪唑7.5 mg/kg。驱虫一周以后，将存储于4℃冰箱内的T.colubriformis L3进行计数，将含有约10 000条L3的悬液灌服两只绵羊。一般在3周后寄生虫感染取得成功，用棉布制作的收集袋收集感染羊的粪便，与适量灭菌的锯末混匀置于医用搪瓷盒，在25℃恒温培养箱中培养10 d，为了保持湿度其间需喷洒适量灭菌水并搅拌混匀。经过一段时间后L3会自动爬上搪瓷盖，这时用灭菌蒸馏水冲洗L3到250 ml烧杯中。过滤去除液体中的杂质，用贝尔曼分离装置分离6 h将活跃的幼虫浓缩进小试管中，同时含有幼虫的沉积物用灭菌蒸馏水以5 min 1 000 rpm的速度离心清洗4次，每次离心后弃去上清液。在清洗后的幼虫液中取20μl的等份试样5份分别进行计数以对悬浮总的L3数量进行估算。

1.2.2真菌纯化中所使用的秀丽隐杆线虫将秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）放置在含有NGM培养介质的培养皿中，通过将培养基与无菌蒸馏水浸泡1 min来吸取线虫。浸泡液使用贝尔曼分离漏斗将这些线虫分离进小试管中。之后，将线虫用无菌蒸馏水以10 min 500 rpm离心，清洗4次，每次离心后弃去上清液。为了估计C.elegans的数量，采用20 μl等份试样5份分别进行计数然后对悬浮液中的C.elegans总数进行估算。

1.2.3本研究中对食线虫真菌的分离对食线虫真菌的分离是根据Saumell等人［8］描述的方法进行的。用灭菌镊子取2～3 g样品放在WA培养基上，呈三角形。每份样品接种3个平行，样品应尽量放在平皿中央，这样便于生长情况的观察。置于25℃恒温箱，培养1周后加入诱饵线虫3 000～4 000条/皿，继续培养。加入线虫后的第2天，在倒置显微镜（Leica，DMIL型）下对每个平皿全面镜检，共镜检5～6次，当发现虫子被菌丝缠住或已经出现特殊的捕食器官时进行详细标记。

1.2.4本研究中捕食线虫性真菌的纯化从已标记的培养皿中，挑取菌丝或已被捕捉到的线虫将其转移到新的WA培养基中。继续培养，从接种的第2天开始，每天观察1次，等到菌丝长至培养皿的2/3时，加入3 000～4 000条/皿C.elegans，培养至出现捕食结构或产生孢子时，再挑取含有菌丝、捕食结构或孢子的培养物转接于WA培养基中培养。当在镜下看到该菌丝的分枝、捕食器官相一致时，说明该株已经纯化好。

1.2.5分离株的鉴定采用玻片法［9］来观察分生孢子形态、着生方式及孢子梗等形态：把纯化分离菌株接种到WA培养基上，置25℃恒温箱里培养，24 h后在倒置显微镜下观察菌丝生长情况，当肉眼能看到菌丝时，以45°角倾斜插入4个灭菌的盖玻片，继续培养。等一周后菌丝覆盖盖玻片时，取出盖玻片用乳酚棉兰染色制片，在光学显微镜（Leica，DME型）下观察并拍照记录。

采用琼脂块法观察捕食结构：同上所述，待菌落生长至平皿的2/3时，加入诱饵线虫3000～4000条，12 h后在倒置显微镜下观察，当发现捕食器官或线虫已被捕食时做好标记。在超净工作台里用直径1 cm的打孔器进行打孔，将打好的琼脂块放置在载玻片上滴一滴棉兰染液，立即放置在光学显微镜下观察拍照。

2　结果

2.1 Arthrobotrysmusiformis的分离

从云南省普洱市思茅区刀官寨采集了20份新鲜的绵羊粪便样品中分离到1株真菌。

2.2分离株的鉴定

在WA培养基上菌落无色至白色，放射性生长；营养菌丝无色至白色，有分枝且分隔，宽为1.25～10 μm；分生孢子梗没有分枝，直立，8～11个分隔，长162～387.5 μm，孢子梗基部宽6～8.25 μm，向上渐细，顶端宽3～5.75 μm，顶端形成烛台状分枝（图A和图B）；在短而小的齿梗上产生3～12个分生孢子，稀疏，呈头状排列（图C和图E）；分生孢子无色，长椭圆形，直或稍弯，远轴端钝圆，向基部逐渐收缩，1个分隔（图D）；大小为21.25～35（27.86）×6.25～12.5 （8.92）μm，培养第3 d开始可产生分生孢子。厚垣孢子黄色，球形或椭圆形，单生或串生，直径14～22 μm，一般在培养20 d后形成。捕食器为粘性网，在WA培养基上即使不加线虫诱导时，也可自发形成三维粘性网（图F）。

3　讨论

捕食线虫性真菌捕食结构的类型取决于种以及环境条件，甚至同一种中的不同株结构也有差异［10］。在本研究中分离出来的该菌株在营养菌丝侧面长出分枝，分枝弯曲、融合到原来的枝上，形成单个菌环，在原有的菌环上或原来的枝上长出新的菌环，从而形成三维粘性网。

注：比例尺=30 μm

根据张克勤［11］等人的研究，在WA培养基上，菌落呈无色至白色；菌丝稀疏、无色；分生孢子梗无色，直立，分隔，没有分枝，梗具有短的小齿梗，顶端形成烛台状分枝；分生孢子无色，长的椭圆形，直或稍弯，远轴端钝圆，向基部逐渐收缩，1个分隔。这与节丛孢属的特性相一致。许多节丛孢属（Arthrobotrys）不能自发形成捕食结构，而捕食结构的形成依赖于环境条件。一种捕食线虫性真菌一般仅产生一种类型的捕食器官，但在能够产生非收缩环的真菌中，一些种可产生几种不同的捕食结构。

该菌的分生孢子梗与圆锥节丛孢（A.conoides）相似，都为无色，直立，不分枝，但该种顶端形成烛台状分枝，在短而小的齿梗上产生3～12个分生孢子，稀疏，呈头状排列。而A.conoides顶端渐细，孢子梗通常只有1～2个瘤节，瘤节上可着生多个孢子，分生孢子在梗上呈头状紧密排列。该菌的分生孢子与指状节丛孢（A.dactyloides）相似，A.dactyloides分生孢子粗棍棒形，略弯曲，有一分隔，位于中部，分生孢子大小为35～51.5（42.1）×6.5～8（7.5）μm，但二者的区别是前者的捕食结构为三维粘性网，后者为收缩环。该菌能产生黄色的厚垣孢子，呈球形或椭圆形，单生或串生，直径14～22 μm，一般在培养20 d后形成，而A. conoides和A.dactyloides不产生厚垣孢子。该菌从分生孢子形状大小及其分隔数，分生孢子梗的长度、着生分生孢子数及顶端形成独特的烛台状分枝，有厚垣孢子，捕食结构为三维粘性网，这与李天飞［12］等所描述的弯孢节从孢相一致。

在自然环境中，为了抵抗外界恶劣环境或者在不适合自身生存条件下，该菌自发产生分生孢子或厚垣孢子。当遇到适宜环境时，且存在大量的虫卵形成幼虫时会诱导环境中的捕食性真菌形成特定的捕食结构，从而可以部分减少环境中自由生活阶段线虫的数量。因此，相应的减少了家畜在这个时期的线虫感染率。本研究中弯孢节丛孢是从绵羊的新鲜粪便中分离的，从理论上来说，应具有抗消化的能力，所以该菌作为候选菌种是很有希望的。

［1］徐春兰，刘伟，王逢会，等.温度和pH对捕食性线虫分离株—长孢隔指孢菌生长的影响及生物学特性的观察［J］.西北农业学报，2015，24（6）：110-115.

［2］Larsen，M.，P.Nansen，J.Gronvold，et al.Biological control of trichostrongyles in calves by the fungus Duddingtonia flagrans fed to animals under natural grazing conditions［J］.Veterinary Parasitology，1995，（55）：266-288.

［3］Eysker，M，N.Bakker，Y.A.vander Hall，et al.The impact of daily Duddingtonia flagrans application to lactating ewes on gastrointestinal nematodes infection in their lambs in the Netherlands［J］.Veterinary Parasitology，2006，（141）：91-100.

［4］杨晓野，吴彩艳，杨连茹，等.口服少孢节丛孢菌孢子对家畜粪便线虫幼虫的杀灭研究［J］.畜牧兽医学报，2005（9）：927-930.

［5］徐镔蕊，秦泽荣，缪作清.动物寄生线虫的生物防治研究进展［J］.农业生物技术学报，1999，7（3）：287-93.

［6］Tzean SS，Liou JY.Nematophagous resupinate basidiomycetous fungi［J］.Phytopathology，1993，（83）：1015-20.

［7］徐镔蕊，秦泽荣，陈刚，等.节丛孢属捕食线虫真菌对体外奥斯特线虫幼虫的捕食效果［J］.中国兽医杂志，1999，25 （2）：8-9.

［8］Singh，K.P.，Kumar，D.，Bandyopadhyay，P.A new technique for single spore isolation of two predacious fungi forming constricting ring［J］.Mycobiology，2004，（32）：197-198.

［9］苏鸿雁，李明，刘晓轩.捕食线虫真菌玻片制作方法的改进［J］.大理学院学报，2006，5（6）：25-30.

［10］Nordbring-hertz B，Jansson H-B，Tunlid A.Nematophagous Fungi［J］.Encyclopedia of life sciences，2006.

［11］李天飞，张克勤，刘杏忠.食线虫菌物分类学［M］.中国科学技术出版社，2000.

［12］张克勤，莫明和.中国真菌志（第三十三卷节丛孢及相关属）［M］.北京：科学出版社，2006.

（编辑：高真贞）

S432.4+4

B

1006-799X（2016）11-0062-03

项目来源：西北民族大学研究生科研创新项目（项目编号：Yxm2015203）

韩元（1994-），女，青海门源人，在读硕士，研究方向为动物寄生虫病防治。

蔡葵蒸（1959-），男，甘肃天水人，教授，研究方向为动物寄生虫病诊断及防治研究。