肉羊二细胞期胚胎（二分胚）移植试验研究

陈　卓，谷红伟，方治中，陶昱菲，李　贺，万鹏程，郭延华，刘长彬*（.新疆农业大学科学技术学院，新疆 乌鲁木齐 8005；.克拉玛依市白碱滩区肉用羊研究所，新疆 白碱滩 84000；.新疆农垦科学院畜牧兽医研究所，新疆 石河子 8000）

肉羊二细胞期胚胎（二分胚）移植试验研究

陈卓1，谷红伟2，方治中2，陶昱菲2，李贺2，万鹏程3，郭延华3，刘长彬3*
（1.新疆农业大学科学技术学院，新疆 乌鲁木齐 830052；2.克拉玛依市白碱滩区肉用羊研究所，新疆 白碱滩 834000；3.新疆农垦科学院畜牧兽医研究所，新疆 石河子 832000）

2014～2015年，在克拉玛依市白碱滩区肉用羊研究所进行了不同品种肉羊超数排卵和胚胎移植（MOET），取二细胞期胚胎进行移植试验。对47只供体采用FSH递减法进行超数排卵处理，通过宫管结合部取胚，回收二细胞期胚胎542枚，平均获得二细胞期胚胎11.5枚。将542枚二细胞期胚胎移植给522只受体，经过45 d后妊娠检查，怀孕阳性受体325只，平均受胎率为62.3%。结果表明，肉羊二细胞期胚胎移植能获得较多的胚胎和较高的妊娠率，为同行从业者提供数据和技术支撑，可以将此项技术在生产实践中加以推广应用。

肉羊；二细胞；胚胎移植

胚胎移植技术俗称为“借腹怀胎”、又称为“受精卵移植”［1-2］。根据胚胎移植来分，可分为原核期、二细胞期和桑椹胚或囊胚期的胚胎移植工作。胚胎移植技术经历了上百年的发展，最早是由英国剑桥大学的Walter Heape学者在1890年4月，用安哥拉兔作为试验动物，成功地获得了世界上第一个动物胚胎移植后代。美国科学家Warwick等，1934年，在绵羊胚胎移植上获得了成功。该技术已发展了82年［3］。根据胚胎移植相关理论基础，胚胎的胚龄与受体羊的子宫所处的阶段越接近，受胎率就会越高。据马保华（2004）报道，供、受体之间同期发情处理后子宫、卵巢同期发情同步差在±1 d或0～24 h，胚胎移植受胎率最高［4-8］。徐平（2001）报道，小鼠二细胞胚胎在不同品种小鼠中进行了二细胞胚胎的移植研究，在移植后12～14 d时，解剖小鼠，获得受胎率平均达到了51%左右［9］。

目前，肉羊胚胎移植工作在全国大部分养殖地区正如火如荼的进行，由此，给肉羊产业化的发展带来了契机，逐年增大纯种肉羊在我国本地羊群中所占的比例，可预见未来几年，我们在餐桌上就将见到颜色鲜美、口感好、脂肪含量低的高档羊肉进入到餐馆。近年来，新疆地区在肉羊胚胎生产及胚胎移植中的投入不断增大，在多地开展了肉羊胚胎移植工作，如：克拉玛依、昌吉、哈密、二师、三师和十师等地，开展了千枚或万枚胚胎移植工程。这些工程的逐年实施将给新疆本地肉羊发展和育种工作带来便利，迎来肉羊育种的曙光。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1试验动物来源本试验材料来源是克拉玛依市白碱滩区肉用羊研究所提供的萨福克、陶赛特、白萨福克和杜泊肉羊。选择繁育过1胎以上的成母羊，年龄段在3～5岁，发情周期正常，无生殖道疾病，膘情适中。

1.1.2主要药品和试剂常用消毒、药品有：新吉尔灭，500 ml/瓶（辽宁修正生物制药有限公司）；75%酒精：100 ml/瓶（新疆佳宁八四消毒液制品有限公司）；碘酒：500 ml/瓶（新疆佳宁八四消毒液制品有限公司）。

促卵泡素（FSH）400 mg/瓶（加拿大）；氯前列烯醇（PG）0.2 mg/支（上海计划生育研究所）；孕马血清促性腺激素（PMSG）1 000 IU/瓶（宁波三生药业股份有限公司）；促黄体生成素（LH）200 IU/支（宁波三生药业股份有限公司）；CIDR 20个/包（新西兰进口）；冲胚液、胚胎保存液等为ICP公司；黄体酮注射液；麻醉药、解麻药和长效土霉素为国产。

1.1.3主要器材常用器材：恒温水浴锅、恒温台、实体显微镜、剪毛剪、止血钳、帕巾钳、手术刀柄和刀片、镊子、手术保定架、平皿（100 mm、35 mm）和四孔板、冲胚管、捡胚针、缝合针和缝合线、采精设备等。

1.2方法

1.2.1供体超数排卵供体羊采用CIDR+FSH+PMSG+ LH法进行处理，FSH总剂量为12.2 ml，递减肌肉注射，每天2次，间隔12 h。放置CIDR阴道栓的第1天设置为0 d，第9～11 d开始肌肉注射FSH，分7次注射，共计注射剂量为12.2 ml，在FSH倒数第2次肌肉注射时，撤出CIDR栓并肌肉注射PMSG，移除CIDR后的24～48 h开始试情，如有发情立即静脉或肌肉注射LH，在发情后的6～8 h阴道输精或10～18 h后采用子宫角输精，在输精后的第6天，采取手术法取胚胎。在手术法取胚胎前的24 h，要给供体羊控食、控水，等待手术。

1.2.2受体同期发情处理受体羊为了降低成本一般是放置海绵栓，放置第1天为0 d，撤栓时间安排在供体羊移除CIDR栓前的6 h受体羊移除海绵栓，同时肌肉注射PMSG，24～48 h受体羊试情，并标记记号，记录发情日期，待供体冲胚日进行受体移植工作。

1.2.3胚胎移植二细胞期胚胎移植采用的是手术法移植，在受体羊后腿两侧芡窝部剃毛、消毒和脱碘，技术人员勾或夹出子宫角细端，另一技术员翻开找到输卵管伞部，并将移胚针从伞口插入输卵管5～12 mm处，将二细胞胚胎放置在此处，缝合后，消毒，待45～60 d时妊娠检查。

1.2.4试验结果进行X2检验。

2　结果与分析

2.1不同肉羊品种对FSH超排效果的影响

4个不同肉羊品种经FSH超数排卵后，卵巢上红体数、卵泡数以及获得二细胞胚胎数、未受精数，详见表1。从表1中可以看出，4个不同肉羊品种，经超数排卵处理后，平均每只供体获得二细胞胚胎数为11.5枚，获得较好的效果。

表1不同品种肉羊超数排卵后所取得的二细胞胚胎数

2.2不同肉羊品种二细胞胚胎受胎率

4个不同肉羊品种二细胞胚胎，经镜检分类，挑出分裂不好的胚胎，搭配正常二细胞胚胎，输卵管伞端移植，于45～60 d B超检查，怀孕阳性率平均达到62.3%。详见表2。

表2不同肉羊品种二细胞胚胎移植结果

3　讨论

3.1不同肉羊品种获得二细胞胚胎数分析

本试验中采用同一厂家的、同一型号的激素，并采取同样的激素处理剂量和方案，得到较好的结果。通过对不同品种试验得出的数据可知，本文所列四个肉羊品种中，平均获得可用二细胞期胚胎11.2枚，平均回收率85.2%，二细胞期胚胎位于输卵管伞端或壶腹部，胚胎集中分布，取卵时从宫管结合部打孔插入先穴式冲胚针，使用冲胚液较少，冲胚液回流好，胚胎回收率高，且易于捡胚操作。在这四个萨福克、陶赛特、白萨福克和杜泊肉羊品种中使用同一超排方案平均获得胚胎10.2、10.3、12.2和14.6枚。通过目测这四个肉羊品种体重均在60～80 kg，说明了基本相同体重的情况下，品种之间的差异不大。同时，因为这四个肉羊品种均为进口品种，且双羔率基本维持在5%～15%左右。从以上两个方面说明了体重悬殊不大和双羔率较低的供体肉羊，在同一超排方案下可以取得较好的胚胎生产效果。

3.2不同肉羊品种二细胞胚胎的移植受胎率

本试验中将获得的全部二细胞期胚胎用于移植研究，从得到的数据可以看出，二细胞期胚胎移植受胎率为62.3%，取得较好的受胎结果，可能与二细胞期胚胎正在处于细胞分裂的基数分裂期，细胞活动旺盛，不易损伤细胞；或二细胞期胚胎移植部位在输卵管壶腹部，更有利于二细胞期胚胎的继续发育［10］。但是二细胞期胚胎移植的成功率受到移植的二细胞期胚胎数和供、受体羊生殖生理周期的同步化程度密切相关［11］。与桑椹胚或囊胚移植相比，在胚胎移植时桑椹胚或囊胚直接移植到子宫角小弯，而二细胞期胚胎则直接被移植送至输卵管壶腹部，这样更有利于胚胎进一步发育，对随后的胚胎着床更为有利［12-14］。

二细胞期胚胎移植工作虽然有诸多优点，如胚胎回收率高、受精率高、节约冲胚液和受胎率较高等等。但是在胚胎生产和移植过程中还是遇到了一些不足之处。主要表现为冲胚时供体羊输卵管伞端易受损伤、输卵管粘连比率高、受体羊手术刀口较大（与腹腔镜手术相比）和伤口愈合的问题等等。这些不足在一定程度上制约了二细胞期胚胎移植的工作效率。因此，有必要进一步深入研究诸多因素对该技术实施效果的影响，配合无菌手术技术将有助于进一步提高二细胞期胚胎移植的工作效率，并将其推广应用于胚胎移植生产实践中。

［1］傅文栋，李风德，牛建克.绵羊胚胎移植研究进展［J］.黑龙江动物繁殖，2010，（18）5：20-21.

［2］侯引绪.绵羊胚胎移植产业化技术研究［D］.北京：中国农业大学，2006.

［3］肖西山，程鹏，李玉冰，等.胚胎移植在家畜生产中的应用［J］.北京农业职业学院学报，2004，60（18）：26-28.

［4］马保华，张红，李键，等.山羊胚胎移植受体同期发情优化程序研究［J］.西南农业学报，2004，17（5）：664-667.

［5］Armstrong D T，Pfitzner A P，Warnes G M，et al.Superovulation treatments and embryo transfer in Angora Goats［J］.J Reprod Fert，1983，67（2）：403-410.

［6］李键，马保华，张红，等.胚胎移植不同品种受体羊同期发情研究［J］.西南农业学报，2005，18（3）：343-347.

［7］马保华，王光亚，赵晓娥.胚胎移植供受体山羊发情控制及配比问题的研究［J］.动物医学进展，1999，20（3）：35-38.

［8］刘长彬，杨永林，张宾，等.阿勒泰大尾羊受体羊同期发情处理程序优化效果［J］.甘肃畜牧兽医，2013，43（1）：36-37.

［9］徐平.不同日龄小鼠的超排、体外受精及二细胞胚胎的比较研究（简报）［J］.实验生物学报，2001，34（3）：253-255.

［10］徐志鹏.波尔山羊胚胎移植及配子移植研究［D］.南京师范大学，2003.

［11］成国祥，王玉阁，成勇.超排山羊卵巢卵母细胞体外成熟和体外受精的研究［J］.中国兽医学报，1997，17（1）：57-60.

［12］张涌，刘泽隆，李裕强.山羊卵泡卵母细胞体外成熟的研究［J］.西北农业大学学报，1999，2：14-18.

［13］刘海军，候容，张美佳.山羊卵泡卵母细胞体外成熟体外受精研究［J］.天津农业科学，2001，7（3）：35-38.

［14］陈大元.受精生物学一受精机制与生殖工程［J］.科学出版社，2001.

（编辑：高真贞）

S821.3+6

B

1006-799X（2016）11-0083-03

兵团院士基金专项（项目编号：2013BB023）；国家级肉羊“胚胎移植基地”和兵团级肉羊“胚胎生产”基地；兵团重大科技项目（项目编号：2013AA003-2）。

陈卓（1989-），男，江苏南通人，硕士，研究方向为动物科学。

刘长彬（1977-），男，河南虞城人，副研究员，研究方向为动物遗传育种与繁殖。