光感基因调控技术对脊髓损伤后膀胱的病理改变及其逼尿肌受体的影响

呼和，张志成，蒋飞，刘佳

(1.大连市儿童医院外二科，辽宁 大连　116021；2.北京军区总医院骨科，北京　100700)



实验研究

光感基因调控技术对脊髓损伤后膀胱的病理改变及其逼尿肌受体的影响

呼和1，张志成2，蒋飞1，刘佳2

(1.大连市儿童医院外二科，辽宁 大连116021；2.北京军区总医院骨科，北京100700)

摘要：目的观察光感基因调控技术对骶上脊髓损伤所致神经源性膀胱功能的影响。方法50只大鼠经尿流动力学检查无异常后进行随机分组，并采用T10脊髓完全横断建立脊髓损伤动物模型，分为假手术对照组、脊髓损伤无蓝光刺激组和脊髓损伤蓝光刺激组，利用HE染色技术对骶髓行蓝光照射前后膀胱的形态学变化进行观察，并且通过Real timePCR技术检测毒蕈碱型乙酰胆碱受体(muscarinic acetylcholine receptor) M2、M3和β3肾上腺素能受体(β3-adrenergic receptor，β3-AR)在大鼠膀胱逼尿肌中的表达。结果与脊髓损伤无蓝光刺激组相比，在HE染色结果中脊髓损伤蓝光刺激组逼尿肌细胞形态大小相对均一，肌纤维排列较有序，趋近于假手术组。Real timePCR技术检测结果显示，与假手术组相比，M2-AR mRNA和M3-AR mRNA的表达在脊髓损伤无蓝光刺激组显著升高(P<0.05)；而经蓝光照射一定时间后，上述两种受体mRNA的表达降低(P<0.05)，β3-AR mRNA的表达与M-AR表达相反。结论光感基因技术可以通过调控逼尿肌受体修复骶上脊髓完全性损伤后神经源性膀胱。

关键词：脊髓损伤；神经源性膀胱；光感基因；乙酰胆碱受体；β肾上腺素能受体

近年来，脊髓损伤(spinal cord injury，SCI)引起的神经源性膀胱(neurogenic bladder，NB)已经日益引起广泛的关注。

目前，对骶上脊髓损伤所致的痉挛性膀胱的治疗虽然已经取得一定程度的进展，但仍然存在许多缺陷。早在1979年，诺贝尔奖获得者Crick博士曾预测说“光很有可能成为特异性调控某一类神经细胞活动的工具”。Channelrhodop sin-2(ChR2)是从单细胞绿色藻类Chlamydomonas reinhardtii中分离出来的一种感光性蛋白质[1]。ChR2的光活化光谱在350～550 nm范围内(中心波长为470 nm)。表达ChR2的细胞在此波段的光照下，ChR2通道打开，Na+、K+、Ca2+等进入胞内，产生内向电流，造成细胞去极化产生动作电位引发细胞兴奋[2]。这样，利用不同波长的光可实现在动物活体水平上对神经细胞进行精确的干预和调控[3]。根据ChR2在神经回路的研究，已经逐渐将其应用于临床神经系统疾病的探索。

本实验采用T10脊髓完全横断建立脊髓损伤动物模型，拟构建ChR2光感基因载体，精确注射于骶上完全性横断性胸脊髓损伤大鼠骶髓双侧副交感神经核(Sacral Parasympathetic Nucleus，SPN)内[4-5]，使其表达ChR2通道蛋白，骶髓行蓝光照射，光感基因活化技术刺激支配膀胱逼尿肌的SPN产生兴奋，利用HE染色技术对骶髓行蓝光照射前后膀胱的形态学变化进行观察，并且通过Real time PCR技术检测毒蕈碱型乙酰胆碱受体(muscarinic acetylcholine receptor)M2、M3在大鼠膀胱逼尿肌中的表达情况，为进一步证实光感基因修复骶上脊髓完全性损伤后神经源性膀胱的可能性提供分子水平的理论依据。

1　资料与方法

1.1实验材料

1.1.1实验动物分组正常成年Sprague-Dawley(SD)雌性大鼠50只，经尿流动力学检查无异常后进行随机分组，分为假手术对照组(A组，10只，仅作背部皮肤肌肉切开和缝合)和脊髓损伤组(B组，40只，暴露脊髓胸腰段，行脊髓完全横断)，采用T10脊髓完全横断建立脊髓损伤动物模型。术后2周进行尿动力检查，以出现逼尿肌亢进及逼尿肌一括约肌协同失调作为神经源性膀胱诊断标准。根据是否植入光感基因行蓝光照射将B组分为C组(损伤无蓝光刺激组)与D组(损伤蓝光刺激组)。

1.1.2主要试剂和仪器10%水合氯醛溶液(北京军区总医院制剂中心)；0.9%氯化钠注射液(石家庄四药有限公司)；注射用青霉素钠(哈药集团制药总厂)；PBS粉剂(北京化学试剂公司)；甲醛溶液(济南鲁康化学工业有限公司)；MP-150生物机能实验系统(美国泰德科技有限公司)；显微手术器械(南昌新长征医疗科技发展有限公司)。

1.2实验方法

1.2.1建立脊髓损伤动物模型麻醉后，以T10椎体棘突为中心沿背侧正中线做长约3.5 cm的纵行切口，依次切开皮肤、皮下组织、深筋膜，并向两边钝性剥离竖棘肌至横突外侧，用撑开器撑开并显露相邻上下胸椎的棘突和椎板，用自制微型咬骨钳向上逐渐依次咬除整个T10椎板及两侧关节突，在咬除过程中避免损伤脊髓的硬脊膜、血管及神经根。将显露的脊髓做横向切断，此时大鼠出现双下肢抽搐、尾巴甩动、随即停止的现象，证实脊髓完全横断。

1.2.2HE染色固定组织制作石蜡切片，石蜡切片脱蜡置水；二甲苯I、Ⅱ分别脱蜡8 min，自来水冲洗；无水乙醇Ⅰ、Ⅱ，75%、80%乙醇分别浸泡3 min；PBS浸泡3 min；置于苏木素溶液中5～10 min，充分水洗；浸饱和碳酸锂还原；置于伊红液中1 min；80%、95%乙醇，无水乙醇I、Ⅱ分别浸泡3 min；PBS浸泡3 min；二甲苯透明、温封。

1.2.3Real-time RT-PCR检测a)引物设计；b)总RNA提取；c)逆转录反应体系及其反应条件；d)Real-time PCR反应体系及反应条件。

扩增条件：变性95℃ 3 min，延伸72℃ 45 s；退火温度是95℃，12 s，40个循环。β-actin的退火温度是62℃，40 s，27个循环。PCR产物进行内加goldview TM核酸染料的2%的琼脂糖凝胶电泳，Quantityone拍照并分析。

表1　逆转录反应体系及其反应条件

表2　Real-time PCR反应体系及反应条件

1.2.4蓝光刺激的方法选择致伤后大鼠，切除L1～2椎板，显露腰骶段硬膜囊，显微镜下切开硬膜囊，根据定位坐标值为脊髓正中两侧0.2 mm，深度0.5 mm，在双侧SPN内注射携带ChR2基因的腺病毒载体(已由中国科学院北京基因组研究所构建完成)，分为上下各三点，每点注射0.1 μL，病毒量为1.0×108单位，注射后留针10 min。选择波长470 nm的蓝光，LED发光二极管(5 mm×3.5 mm)缝合于切口。二极管电源可使用电脑程序控制，从而控制发光的频率和节律(每分钟照射1 s，持续15 min，每日重复3次，照射至脊髓伤后2周)。

2　结　　果

2.1膀胱组织HE染色结果与假手术组相比，脊髓损伤无蓝光刺激组在光镜下观察可见黏膜下层有炎细胞浸润，逼尿肌细胞肥大，排列紊乱，肌细胞胞浆内肌纤维空泡样变明显；脊髓损伤蓝光刺激组逼尿肌细胞形态与大小相对均一，肌纤维排列较有序，趋近于假手术组(见图1～3)。

图1　假手术组膀胱逼尿肌的HE染色(HE，×100)

图2　脊髓损伤无蓝光刺激组膀胱逼尿肌的HE染色(HE，×100)

图3　脊髓损伤蓝光刺激组膀胱逼尿肌的HE染色(HE，×100)

2.2乙酰胆碱受体M2-AR、M3-AR和肾上腺素受体β3-AR的Real-time RT-PCR检测结果Real-time RT-PCR检测结果显示，M2-AR mRNA和M3-AR mRNA的表达与假手术组相比，脊髓损伤无蓝光刺激组显著升高(P<0.05)；而经蓝光照射一定时间后，两种受体mRNA的表达降低(P<0.05)，与假手术组比较，差异无统计学意义(P>0.05，见图4)。

Real-time RT-PCR检测结果显示，损伤无蓝光刺激组β3-AR mRNA的表达与假手术组相比显著降低，P<0.05；而损伤蓝光刺激组与损伤无蓝光刺激组相比，β3-AR mRNA的表达显著升高，有统计学意义(P<0.05，见图5)。

3　讨　　论

注：a-损伤无蓝光刺激组与假手术组比较，P<0.05；b-损伤蓝光刺激组与损伤无蓝光刺激组比较，P<0.05；c-损伤蓝光刺激组与假手术组比较，P>0.05

图4M2-AChR mRNA和M3-AChR mRNA在各组中的表达情况比较

脊髓损伤后神经源性膀胱功能障碍是临床严重的伤残之一。据国内外长期随访研究证实，SCI患者晚期死亡的主要原因是泌尿系感染和肾功能衰竭(43%～75%)[6]。故寻找有效治疗SCI并发症的方法成为目前亟待解决的临床问题。

支配膀胱逼尿肌的神经主要为胆碱能神经[7]，该神经通过副交感神经节后纤维释放的乙酰胆碱作用于膀胱逼尿肌内M受体发挥作用。M受体在逼尿肌中含量最高，尤以膀胱体部含量最高，其含有多种亚型，主要为M2和M3受体[2]。乙酰胆碱通过M3受体直接介导膀胱逼尿肌的收缩，而M2受体不能直接作用于逼尿肌，需要通过抑制乙酰环化酶，进而抑制β受体调节的松弛作用而达到间接介导逼尿肌收缩。采用Real-time PCR测定膀胱逼尿肌细胞M2、M3受体mRNA的表达，实验结果发现脊髓横断损伤后可以引起M2、M3受体mRNA的表达增加，使逼尿肌对神经递质及其类似物更加敏感，兴奋性增加，出现逼尿肌收缩亢进反应，即神经源性膀胱。对脊髓损伤后的老鼠给予一段时间的蓝光刺激，发现M2、M3受体mRNA的表达降低，表明蓝光照射副交感神经核内的光感基因可以通过减少M2、M3受体mRNA的表达进而使逼尿肌细胞的Ca2+和CaM浓度降低，降低逼尿肌的收缩力和逼尿肌兴奋性，减少逼尿肌异常收缩频率。

注：a-损伤无蓝光刺激组与假手术组比较，P<0.05；b-损伤蓝光刺激组与损伤无蓝光刺激组比较，P<0.05；c-损伤有蓝光刺激组与假手术组比较，P>0.05

图5β3-AR mRNA在各组中的表达情况比较

β肾上腺素能受体，主要分布于膀胱体部平滑肌，受交感神经节后纤维释放的神经递质去甲肾上腺素影响，从而控制膀胱的舒张。β3-AR分为三种亚型，其中β3直接介导逼尿肌的松弛[8]。Real-time PCR测定β3-AR结果显示，与假手术组相比，损伤无蓝光刺激组β3-AR mRNA的表达显著降低，损伤蓝光刺激组β3-AR mRNA与损伤无蓝光刺激组相比，表达显著升高。这表明蓝光照射可以影响逼尿肌细胞β3-AR介导的Cyclic Adenosine monophosphate-Protein Kinase A(cAMP-PKA)信号转导途径，提高膀胱储存尿液的能力。

HE染色发现经过一定时间的蓝光照射后脊髓损伤的膀胱在光镜下黏膜下层炎细胞减少，逼尿肌细胞缩小，排列有序，肌细胞包浆内肌纤维空泡样消失，表明在蓝光的刺激下膀胱功能得到一定程度的恢复。

该研究从病理改变和分子水平证实了光感基因调控技术可以改善脊髓损伤后膀胱功能障碍，为进一步的相关研究奠定了理论基础。但是关于光感基因如何调控逼尿肌受体的分子机制尚不十分清楚，有待于进一步讨论。

参考文献：

[1]Sugiyama Y，Wang H，Hikima T，et al.Photocurrent attenuation by a single polar-to-nonpolar point mutation of channelrhodopsin-2[J].Photochem Photobiol Sci，2009，8(3)：328-336.

[2]Boyden ES，Zhang F，Bamberg E，et al.Millisecond-timescale，genetically targeted optical control of neural activity[J].NatNeurosci，2005，8(9)：1263-1268.

[3]柳浦青.光敏感通道(Channelrhodopsin-2)神经回路功能和神经系统疾病研究的新工具[J].中国生物化学与分子生物学报，2010，26(5)：418-422.

[4]何林生，肖传国.大鼠下尿路、腰骶髓脊髓排尿中枢逆行神经追踪研究[J].中华实验外科杂志，2005，22(11)：1360-1361.

[5]Nadelhaft I，Vera PL.Separate urinary bladder and external urethral sphincter neurons in the central nervous system of the rat：simultaneous labeling with two immunohistochemically distinguishable pseudorabies viruses[J].Brain Res，2001，9(3)：33-44.

[6]Devivo MJ.Epidemiology of traumatic spinal cord injury：trends and future implications[J].Spinal Cord，2012，7(5)：780-791.

[7]宋波.逼肌尿兴奋性及逼尿肌不稳定[J].第三军医大学学报，2003，28(2)：1969-1971.

[8]Igawa Y，Yamazaki Y，Takeda H，et al.Function and molecule or biological cvidc-nce For possible P 3-adrenoceptor in the human detrusor musle[J].Br J Pharmacol，2000，12(6)：819-825.

文章编号：1008-5572(2016)07-0612-04

基金项目：国家自然科学基金(81200960)

中图分类号：R683.2

文献标识码：A

收稿日期：2015-10-10

作者简介：呼和(1982- )，男，主治医师，大连市儿童医院外二科，116021。

Effect of Light Gene Regulation on Pathology Changes and Detrusor Receptors of Bladder after Spinal Cord Injury

Hu He1，Zhang Zhicheng2，Jiang Fei1，et al

(1.The Second Surgery Department，Dalian Children′s Hospital，Dalian116021，China；2.Orthopaedic Department，General Hospital of Beijing PLA District，Beijing100700，China)

Abstract：ObjectiveTo observe of the effect of light gene regulation on neurogenic bladder function recovery by the upper-sacral spinal cord injury in rats.Methods50 rats which had no abnormalities after urine flow dynamic test were randomized and the 10 thoracic spinal cord complete transection animal model was set up，dividing into the control group，no blue light stimulation of spinal cord injury group and blue light stimulation of spinal cord injury group.The bladder morphological changes before and after the use of blue light stimulation were observed by HE staining technique.Furthermore，the express of M-AR and β-AR were tested by Real timePCR in the rat bladder detrusor.ResultsCompared with no blue light stimulation of spinal cord injury group，detrusor cells were relatively uniform shape and size while the more muscle fibers arranged in an orderly，closing to control group.Real timePCR technical results show that，compared with the control group，the expression of M2-AR mRNA and M3-AR mRNA in no blue light stimulation of spinal cord injury group was significantly higher (P<0.05) while the express was lower in the blue light stimulation of spinal cord injury group(P<0.05).β3-AR mRNA expression and M-AR expression were contrary.ConclusionLight gene regulation can repair the neurogenic bladder dysfunction of upper-sacral spinal cord injury by regulating the detrusor receptors.

Key words：spinal cord injure；neurogenic bladder；light gene；acetylcholine receptors；β-adrenergic receptor