血浆miR-451水平与子宫内膜异位症的关系

石瑾秋，卢健翔，李宝艳



·论著·

血浆miR-451水平与子宫内膜异位症的关系

石瑾秋，卢健翔，李宝艳

目的：探讨血浆微小RNA451（miR-451）与子宫内膜异位症（EMs）的关系，并观察miR-451对体外培养的子宫内膜基质细胞的增殖和迁移的作用。方法：选取2014年1月—2015年5月于深圳市罗湖区人民医院就诊的EMs患者（EMs组）54例，正常对照组59例，采血并提取血浆总RNA。采用实时荧光定量聚合酶链反应（real-time qPCR）检测血浆miR-451的表达强度。通过CCK-8实验检测miR-451对异位子宫内膜基质细胞增殖的调控作用；采用损伤愈合实验探讨过表达miR-451后异位子宫内膜基质细胞的迁移变化。结果：EMs患者血浆miR-451表达水平低于对照组［（0.53±0.14）vs.（1.00±0.20），t=14.50，P＜0.01］；过表达miR-451后EMs基质细胞的相对迁移活性下降［（1.00±0.12）vs.（0.74±0.02），t=4.73，P=0.001］。结论：EMs患者血浆miR-451水平减低；miR-451可能通过抑制异位内膜基质细胞增殖和迁移发挥作用。

子宫内膜异位症；微RNAs；子宫内膜；聚合酶链反应；miR-451

【Abstract】Objective:To analyze the level of plasmamiR-451 in patientswith endometriosis（EMs），and to investigate the effect of miR-451 on the proliferation and migration of the stromal cells cultured in vitro. M ethods：We recruited 54 cases of EMs and 59 healthy volunteers from January 2014 to May 2015 at People′s Hospital of Luohu District.Total RNA from plasma were extracted，and the expression of plasma miR-451 was analyzed with real-time qPCR.The proliferation viability of stromal cells was detected by CCK-8 assay，and migration by the wound-healing assay.Results：The level of plasma miR-451 in EMs patients was significantly lower than that in healthy volunteers［（0.53±0.14）vs.（1.00±0.20），t=14.50，P＜0.01］.Overexpression ofmiR-451 in the in vitro cultured stromal cells significantly inhibited the proliferation and migration of stromal cells［（1.00± 0.12）vs.（0.74±0.02），t=4.73，P=0.001］.Conclusions：The level of plasmamiR-451 is lowered in patients with EMs.miR-451 may participate in the pathophysiologicalmechanism of EMs by the inhibition of proliferation and migration of ectopic stromal cells.

【Keywords】Endometriosis；MicroRNAs；Endometrium；Polymerase chain reaction；miR-451 （JIntReprod Health/Fam Plan，2016，35：282-284）

子宫内膜异位症（endometriosis，EMs）是一种常见的妇科疾病。该病是一种有侵袭行为的良性疾病，严重影响患者的生活质量，特别是对于育龄期妇女，该病可导致女性不孕症，给患者造成严重的心理负担［1-3］。然而，目前EMs尚缺少令人满意的治疗方法。因此，研究并发现新的治疗靶点对EMs的个体化治疗有重要意义。

微小RNA（microRNA，miRNA）是近年来研究较多的生物活性分子。越来越多的研究表明miRNA与EMs的发生发展密切相关［4-5］。miRNA可通过靶向作用于mRNA来调控相应蛋白的表达，其主要在细胞内发挥作用，也可透过细胞膜分泌到血浆中。因此，检测血浆miRNA的表达即可反映细胞内调控状态的变化。miR-451是一种EMs相关miRNA，其在多种疾病中表达发生显著变化，如恶性肿瘤、炎症等［6-7］。在EMs动物模型中，miR-451的表达下调［8］。然而，miR-451在EMs患者血浆中的变化尚不清楚。因此，本研究拟通过检测EMs患者血浆中miR-451的表达，初步探讨其作用机制，分析miR-451与EMs之间的相关性，为寻找EMs治疗的新靶点提供实验依据。

作者单位：518001广东省深圳市罗湖区人民医院妇科微创治疗中心

通信作者：李宝艳，E-mail：szlby150@hotmail.com

1　材料与方法

1.1研究对象选取2014年1月—2015年5月于我院就诊且病理学证实为EMs的患者（EMs组）54例（Ⅰ/Ⅱ期患者13例，Ⅲ/Ⅳ期患者41例），年龄（31.4±2.5）岁；另选取同期来我院体检的健康志愿者（对照组）59例，年龄（28.5±3.8）岁。

1.2样品收集与血浆m iRNA提取EMs患者血浆均取自月经分泌期，采用乙二胺四乙酸二钾（EDTA-K2）抗凝管采集晨间血液，离心，分离血浆存于-80℃冰箱保存备用。采用mirVanaTMPARISKit试剂盒（Thermo Fisher）按照使用说明提取血浆miRNA。加入线虫Cel-miR-39作为内参。提取完毕后，检测RNA浓度、稀释至等浓度并进行后续实验。

1.3实时荧光定量聚合酶链反应（real-time qPCR）检测血浆m iR-451的表达采用TaqMan探针real-time qPCR法分别检测各样品中miR-451及Cel-miR-39的表达，以miR-451相对Cel-miR-39的表达作为各样品miR-451的相对表达量。以对照组miR-451的相对表达量设为1，EMs组miR-451的表达以相对于对照组的变化倍数表示。

1.4异位子宫内膜基质细胞的分离及培养异位子宫内膜组织取自经病理证实为EMs的患者，经手术切除巧克力囊肿组织后修剪周围正常组织并刮取异位内膜组织。并将组织剪碎经Ⅰ型胶原酶于37℃下消化，将悬液进行差速贴壁1 h，反复清洗并弃去未贴壁细胞。之后将贴壁细胞采用含有10%胎牛血清的DMEM/F12培养基（Thermo Fisher）继续培养、传代。

1.5CCK-8实验将1.4中所述的EMs基质细胞消化，接种于96孔板中，待细胞贴壁后首先测定450 nm处0 h基准点吸光度值。之后采用Lipofectamine 3000（Thermo Fisher）分别将miR-451类似物及阴性对照（Scramble）通过脂质体法转染EMs基质细胞，分别在转染后12，24，48 h后检测各组450 nm处吸光度值。以0 h基准点吸光度值设为1，以各组吸光度的相对值反映相对增殖活力，并绘制增殖曲线。

1.6损伤愈合实验将细胞接种至6孔板，采用Lipofectamine 3000（Thermo Fisher）分别将miR-451类似物及阴性对照转入EMs基质细胞中。待细胞生长至完全融合后，采用无菌Tip头划痕，并在18 h后拍照观察各组细胞的迁移情况。

1.7统计学方法统计学分析采用SPSS 13.0软件处理，定量资料用均数±标准差（±s）表示，组间均数比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1EM s患者血浆m iR-451表达下调EMs患者血浆miR-451下降至对照组的53%［（0.53±0.14）vs. （1.00±0.20），t=14.50，P＜0.01］。

2.2过表达m iR-451抑制EM s基质细胞增殖采用CCK-8实验检测转染miR-451后24，48 h，EMs基质细胞的相对增殖活性较阴性对照组降低（均P＜0.01），见图1。

图1　过表达m iR-451后EM s基质细胞的相对增殖活性

2.3过表达m iR-451后抑制EM s基质细胞的迁移损伤愈合实验显示，过表达miR-451后EMs基质细胞的迁移入划痕区的细胞数目明显减少（见图2A），过表达miR-451后EMs基质细胞的相对迁移活性较阴性对照组降低［（1.00±0.12）vs.（0.74±0.02），t=4.73，P=0.001］，见图2B。

3讨论

miRNA是细胞内有调控作用的非编码小分子RNA。近来研究发现，miRNA参与多种疾病的进程，因此探讨miRNA对疾病的调控作用对揭示疾病的发病机制、设计新的治疗靶点有重要意义。EMs是一种常见的妇科疾病，但其发病原因未知，目前尚无特效的治疗方法。本研究发现，miR-451在EMs患者血浆中降低，提示miR-451很可能在EMs中起重要的调控作用。

miRNA分子质量小，容易通透出细胞膜并释放进入血中。因此，检测血浆中miRNA的表达可反映出相应细胞中调控的变化。miR-451具有重要的生理功能，其表达变化与多种疾病有关，如肿瘤、炎症等［6-7］。然而，miR-451与EMs的关系至今尚存有争议。在人类和其他灵长类动物中，EMs可导致miR-451的下调，同时伴有靶基因YWHAZ的上调［6］。而在小鼠EMs模型中，miR-451表达缺失小鼠比野生型小鼠EMs病灶更少，提示miR-451很可能是加重EMs的因素［9］。在子宫内膜上皮细胞中过表达miR-451通过抑制迁移抑制因子（migration inhibitory factor，MIF）表达抑制上皮细胞的生存［10］。miR-451与细胞迁移、增殖等生物学过程有密切关系。以往研究表明，体外水平过表达miR-451可显著抑制胃癌细胞迁移［11］。本研究也发现，miR-451过表达可减弱EMs基质细胞的增殖和迁移活性。因此，上述结果共同提示，miR-451在不同种属的动物模型中可能发挥不同的作用，且miR-451在子宫内膜上皮细胞和基质细胞中所起的调控作用不同。

miR-451的靶点较多，目前已被证实的与EMs相关的靶基因包括YWHAZ、MIF和纤维蛋白原α （fibrinogenα，FGA）异构体2［6，12-13］。但是这些靶基因如何进一步调控EMs的进展尚需进一步研究。本研究发现，miR-451在EMs患者血浆中下调，并可通过抑制EMs基质细胞的增殖和迁移参与EMs的调控。综上，miR-451是重要的EMs相关miRNA，然而miR-451在EMs中的具体调控机制仍需进一步研究证实。

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［本文编辑王琳］

The Relationship between Plasma m iR-451 and Endometriosis

SHI Jin-qiu，LU Jian-xiang，LI Bao-yan.The Minimally Invasive Center，Department of Gynecology，The People′s Hospital of Luohu District，Shenzhen 518001，China

LIBao-yan，E-mail：szlby150@hotmail.com

（2016-04-14）