蟾酥的高效液相指纹图谱研究*

姬　诚　郭万周



【实验研究】

蟾酥的高效液相指纹图谱研究*

姬诚郭万周

南阳医学高等专科学校(南阳 473061)

摘要：目的建立评价蟾酥饮片质量优劣的指纹图谱分析方法。方法采用高效液相色谱法，Allitma 反相C18色谱柱(250mm×4.6mm，5.0μm)，流动相为0.1%甲酸水溶液-乙腈梯度洗脱，检测波长为296nm，流速0.7ml/min，柱温为30℃。用指纹图谱相似度评价软件计算相似度。结果该方法精密度、重现性、稳定性和各共有峰相对保留时间RSD均小于5%，各产地样品的相似度大于95%。结论用蟾酥高效液相指纹图谱分析法，可较全面地反映蟾酥饮片的内在质量，可用于蟾酥饮片的质量控制。

关键词：蟾酥；高效液相色谱法；指纹图谱

蟾酥为蟾蜍科动物中华大蟾蜍Bufo bufo gargarizans Cantor或黑眶蟾蜍Bufo melanostictus Schneider的干燥分泌物。性温、味辛，有毒，归心经，具有解毒、消肿、止痛、开窍醒神之功效，主要用于治疗痈疽疔疮、瘰疬、咽喉肿痛、牙痛、痧胀腹痛和神昏吐泻等症[1,2]。现代药理学研究表明：蟾酥具有强心、升压、抗肿瘤、抗心肌缺血等功效[3]。

本文采用高效液相色谱法建立了蟾酥药材的指纹图谱，并标定出8个共有指纹峰，同时对其指纹图谱进行相似度评价，为蟾酥药材的质量标准的建立及其质量控制提供依据[4,5]。

1　仪器与试药

Agilent-1200 高效液相色谱仪；1200VWD紫外检测器;AgilentLC工作站;Milli-Q超纯水机；中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件(2004A,国家药典委员会)。12批蟾酥药材(见表1)购自山东、江苏以及四川省的不同地区，经鉴定均为中华大蟾蜍(Bufo bufo gargarizans Cantor)或黑眶蟾蜍(Bufo melanostictus Schneider)的干燥分泌物。色谱纯乙腈 (Fisher公司);分析纯甲酸(北京第二化工厂)。

对照品华蟾酥毒基、脂蟾毒配基购自中国药品生物制品检定所，蟾毒灵、蟾毒它灵对照品购自上海鼎瑞化工有限公司，日蟾毒它灵对照品购自南昌贝塔生物科技有限公司，沙蟾毒精、远华蟾毒精对照品购自江西本草科技有限责任公司。

2　方法

2.1色谱条件色谱柱：GraceAllitmaC18(4.6mm× 250mm，5μm)；流动相：乙腈(A)-0.1%甲酸水溶液(B)，梯度洗脱(0～15min，A为30%～62%；15～30min，A为62%)；检测波长：296nm；柱温：30 ℃；流速：0.7ml/min；进样量：20μL。

2.2对照品溶液的制备精密称取华蟾酥毒基、脂蟾毒配基、蟾毒灵、日蟾毒它灵、蟾毒它灵、沙蟾毒精、远华蟾毒精对照品适量，加甲醇溶解，作为对照品溶液，浓度分别为华蟾酥毒基0.952mg/mL、脂蟾毒配基0.696mg/mL、蟾毒灵0.266mg/mL、日蟾毒它灵0.224mg/mL、蟾毒它灵0.344mg/mL、沙蟾毒精0.232mg/mL、远华蟾毒精0.104mg/mL。再各精密吸取1mL，置10mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过后作为混合对照品溶液。

2.3供试品溶液的制备取各地产蟾酥药材细粉0.1g，精密称定，加入甲醇20ml，超声处理60min，放冷，定容至25mL，摇匀，0.45μm微孔滤膜过滤后，作为供试品溶液。

2.4方法学考察

2.4.1精密度试验分别精密吸取同一供试品溶液。连续进样5次，按上述方法色谱条件测定。计算各峰峰面积RSD值<1% 表明该方法精密度良好。

2.4.2稳定性试验精密吸取同一供试品溶液。分别在0、2、4、8、12、24h时进样，按上述方法色谱条件测定。计算各峰峰面积RSD值<1%，表明该供试品溶液在24h内稳定。

2.4.3重复性试验取同一批蟾酥药材按供试品制备方法制备供试品溶液5份，测定HPLC色谱图。计算各峰峰面积RSD值<3% 表明该方法重复性良好。

2.5蟾酥药材指纹图谱的建立取蟾酥药材样品12批，按照“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项色谱条件，分别进样20ul，记录色谱图(图1)。结果12批药材有8个特征指纹峰，其中7号峰为华蟾酥毒基，1号峰为日蟾毒它灵，2号峰为沙蟾蜍精，3号峰为远华蟾毒精，4号峰为蟾毒它灵，6号峰为蟾毒灵，8号峰为脂蟾毒配基，以华蟾酥毒基的保留时间为参照，计算各产地药材共有指纹峰的相对保留时间的差异，结果RSD均小于5%。

图1　不同产地蟾酥的HPLC指纹图谱

2.6相似度计算指纹图谱相似度评价采用国家药典委员会开发的中药色谱指纹图谱相似度评价系统研究版(2004A)进行计算。首先将色谱工作站数据导入中药指纹图谱相似度计算软件，以中位数法产生对照指纹图谱，分别计算不同批次的样品与对照图谱之间的相似度。12批蟾酥药材的相似度结果见表1。

表1　蟾酥药品来源及相似度计算结果

3　讨论

在预试验中，对比了不同浓度甲醇、乙醇，超声提取、加热回流、冷浸提取等不同提取方法对蟾酥指纹图谱的影响，结果表明，甲醇超声提取所得图谱指纹峰比较丰富，并且操作简单。另外，课题组也比较了甲醇-水、乙腈-水以及不同比例的乙腈-水-甲酸、乙腈-水-乙酸等多种流动相的梯度洗脱效果，结果表明，选用乙腈-0.01%甲酸水溶液系统以合适的梯度洗脱所得指纹图谱分离效果和峰型最好。全波长扫描发现在296nm处有蟾酥毒基类成分的最大吸收，综合考虑选定296nm为检测波长。本实验建立了蟾酥药材的指纹图谱，确立了8个共有峰，导入中国药典委员会颁布的中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件，结果12批样品指纹图谱的相似度均在 95.6% 以上，相似度较好，可用于蟾酥药材的定性质量评价，为蟾酥及其制剂质量标准的制定提供补充。

参考文献

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[M].北京：中国医药科技出版社,2015：383.

[2]高学敏.中药学[M].北京：中国中医药出版社,2007:512-513.

[3]巩丽丽,李景香,张会敏.蟾酥药理作用及制剂工艺的研究进展[J].食品与药品，2007,9(10)：51-53.

[4]石玉娟,解军,李桂兰.山西省不同产地中药材黄芪HPLC指纹图谱研究[J].光明中医,2010,25(5):790-791.

[5]陈红,程再兴,肖永庆. 炮制前后栀子饮片HPLC指纹图谱比较研究[J].光明中医,2009,24(6)：1044-1055.

*基金项目：河南省南阳市科技攻关项目(No.2015KJGG08)

doi:10.3969/j.issn.1003-8914.2016.12.021

文章编号：1003-8914(2016)-12-1727-03

收稿日期：(本文校对：贾荷丽2015-11-27)

Study on the High Performance Liquid Chromatography Fingerprint of Venenum Bufonis

JI ChengGUO Wanzhou

(Nanyang Medical College, Henan, Nanyang 473061, China)

Abstract：ObjectiveTo establish a HPLC-fingerprint method for evaluating the quality of Venenum Bufonis medicinal slices. MethodsThe separation was performed on the Allitma C18 column (250mm×4.6mm, 5.0μm) with the gradient elution of 0.1% formic acid aqueous solution-acetonitrile as the mobile phase at the rate of 0.7 mL/min. The detection wavelength was 296 nm, and the column temperature was 30℃. The similarity was calculated by fingerprint similarity evaluation software. ResultsThe RSD of precision, reproducibility and stability for this method were less than 5%. The similarity of these samples was more than 95%. ConclusionThe HPLC fingerprint can comprehensively reflect the inner quality of Venenum Bufonis medicinal slices, and can be used to control its quality.

Key words：Venenum Bufonis; HPLC; Fingerprint