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不同纳米材料作为基因载体的效率比较

2016-08-11董亚贤尧慧燕梁兵钟高贤刁芳明

中国实用医药 2016年20期
关键词:质粒纳米材料靶向

董亚贤+尧慧燕+梁兵+钟高贤+刁芳明+石红婷

【摘要】 目的 比较不同靶向纳米材料作为基因载体的细胞毒性大小及其转染效率。方法 以聚乙烯亚胺(PEI)为对照, 化学合成髓鞘碱性蛋白68-86(MBP68-86)-多聚赖氨酸(PLL)-聚乙烯亚胺-聚乙二醇(PEG)接枝支化特异性配体乳铁蛋白 (Lf)及PLL-PEI-PEG, 并采用MTT法检测细胞毒性, 倒置显微镜荧光观察法和流式细胞仪法检测转染效果。结果 MBP68-86-PLL-PEI-PEG-Lf细胞毒性比PLL-PEI-PEG及PEI低, 三组两两比较差异有统计学意义(P<0.05);MBP68-86-PLL-PEI-PEG-Lf/pAAV-EGFP 的转染效率为(41.8±0.9)%;PLL-PEI-PEG/pAAV-EGFP的转染效率为(28.4±1.1)%;PEI/pAAV-EGFP 为的转染效率(20.5±1.2)%, 两两比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论 MBP68-86-PLL-PEI-PEG-Lf和PLL-PEI-PEG可作为基因转染的传输载体, 其中MBP68-86-PLL-PEI-PEG-Lf最好。

【关键词】 纳米材料; MBP68-86-PLL-PEI-PEG-Lf;基因载体;PLL-PEI-PEG

DOI:10.14163/j.cnki.11-5547/r.2016.20.193

目前所有的基因治疗研究领域, 都存在转基因载体系统在转染效率、定向性、可控性、安全性等方面的不足[1]。而纳米载体凭借其低毒、高效负载等优点在基因治疗中发挥越来越重要的作用。作者前期实验已经成功合成并验证了PLL-PEI-PEG[2] 。因此, 本文在前期实验的基础上合MBP68-86-PLL-PEI-PEG-Lf, 并在体外比较不同新型靶向纳米材料的细胞毒性和转染效率, 以筛选出更加高效、低毒和高靶向性的基因载体, 为神经系统的基因治疗带来新的希望。

1 材料与方法

1. 1 细胞来源及培养 大鼠单个核细胞(PBMC)购自美国ATCC公司, 由本实验室保存。采用加有10% 胎牛血清(FBS)和1%抗生素(青霉素/链霉素)的DMEM培养基培养。

1. 2 PLL-PEI-PEG-Lf/MBP68-86的制备 MBP68-86用Traut试剂硫酸化后再与纳米材料以分子比4∶1混合, 在室温下反应1h, 去除过剩的MBP68-86。

1. 3 质粒DNA(pDNA)的制备 质粒在大肠杆菌中扩增, 然后用质粒提取试剂盒提取纯化。得到的质粒通过紫外分光光度计检测其纯度和浓度。检测合格的质粒保存于-20℃保存备用。

1. 4 MBP68-86-PLL-PEI-PEG-Lf/质粒DNA复合物的制备 在Eppendorf管中, 将1 μg pDNA稀释在50 μl不含FBS的DMEM中, 振荡均匀, 按不同N/P比把相应量的纳米材料加入到另外一管装有50 μl不含FBS的DMEM的Eppendorf管中, 然后把两溶液在室温下振荡5min得到均匀复合物。

1. 5 细胞毒性 采用四唑盐(MTT)比色法检测细胞毒性, 具体方法参见文献[2]。

1. 6 细胞转染效率 采用倒置荧光显微镜观测转染结果, 并采用流式细胞术检测转染效率, 具体转染过程及检测方法参见文献[2]。

1. 7 统计学方法 采用SPSS17.0统计学软件进行数据统计分析。计量资料以均数±标准差( x-±s)表示, 采用t检验;计数资料以率(%)表示, 采用χ2检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2. 1 细胞毒性检测结果 采用MTT检测细胞毒性。当N/P<10时, 三种纳米材料载体的细胞存活率都>80%;在N/P=15时, MBP68-86-PLL-PEI-PEG-Lf/pAAV-EGFP为78%, PLL-PEI-PEG/pAAV-EGFP为63%, 比PEI/pAAV-EGFP的细胞存活率(52%)要高, 两两比较差异有统计学意义(P<0.05);N/P<15时, MBP68-86-PLL-PEI-PEG-Lf/pAAV-EGFP和PLL-PEI-PEG/pAAV-EGFP的存活率相当, 但两者比PEI25kD/pAAV-

EGFP要高, 只是在N/P>15时MBP68-86-PLL-PEI-PEG-Lf/pAAV-EGFP的细胞存活率才比PLL-PEI-PEG/pAAV-EGFP和PEI/pAAV-EGFP低, 两两比较差异有统计学意义(P<0.05)。

纳米材料形成复合物后在PBMC细胞中的细胞毒性。见图1。

2. 2 细胞转染效果

2. 2. 1 倒置荧光显微镜观测细胞转染效果 采用倒置荧光显微镜观测细胞转染效果, 发现在N/P=15时载体绿色荧光蛋白表达量最多, 同时MBP68-86-PLL-PEI-PEG-Lf/pAAV-EGFP 的细胞荧光表达效果比PLL-PEI-PEG/pAAV-EGFP和PEI/pAAV-EGFP要好。

2. 2. 2 流式细胞仪检测细胞转染效果 本实验还利用流式细胞仪检测了N/P=15时三种纳米材料的转染效率, 结果发现MBP68-86-PLL-PEI-PEG-Lf/pAAV-EGFP 的转染效率为(41.8±0.9)%;PLL-PEI-PEG/pAAV-EGFP的转染效率为(28.4±1.1)%;PEI/pAAV-EGFP 为的转染效率(20.5±1.2)%, 两两比较差异有统计学意义(P<0.05)。

3 讨论

新型纳米材料作为基因载体具有良好的安全性和生物相容性[3]。近来许多实验[4, 5]通过改变阳离子聚合物的结构或对其进行化学修饰而降低毒性, 并实现高转染效率。在以前的工作中, 作者已经成功合成并验证了靶向、高效及可降解型PLL-PEI-PEG基因载体, 并作了相关的报道[2]。由于乳铁蛋白(Lf)可通过受体介导的跨细胞转运通过血脑屏障。考虑到这一点, 作者拟将Lf主要结构序列连接到PEG末端, 从而使这种纳米材料PLL-PEI-PEG-Lf可通过跨细胞转运进入脑组织。虽因PLL-PEI-PEG-Lf可透过血脑屏障进入脑组织, 但对脑的不同组织并无特异性。因此本实验在PEG的基础上加以MBP68-86修饰, 使新的载体同时具备血脑屏障穿透性和活化的免疫细胞靶向性。

同样用量的时候MBP68-86-PLL-PEI-PEG-Lf的毒性最低。基因载体除了应具有较低的毒性, 较高的转染效率也非常关键。MBP68-86-PLL-PEI-PEG-Lf的转染效果较PLL-PEI-PEG及PEI好, 另外流式细胞仪检测也证实了同样的结果。由此可以得出MBP68-86-PLL-PEI-PEG-Lf作为基因传输载体较好。

综上所述, MBP68-86-PLL-PEI-PEG-Lf和PLL-PEI-PEG都可作为基因传输的载体, 但由于MBP68-86-PLL-PEI-PEG-Lf作为PLL-PEI-PEG的改进品, 各方面的性能都优于PLL-PEI-PEG, 因此具有更高的可塑性和价值。

参考文献

[1] 梁兵, 袁芳, 杨宁, 等. 3种不同类型基因导入系统转染类神经元细胞的效率比较.重庆医学, 2012, 41(18):1792-1798.

[2] 董亚贤, 石红婷, 梁兵, 等. 新型靶向纳米材料作为基因载体的评估. 现代预防医学, 2015, 42(13):2405-2408.

[3] 梁兵, 袁芳, 殷建瑞, 等. 纳米材料PEG-PEI介导双基因促体外拟神经细胞凋亡的作用. 山东医药, 2012, 52(25):1-4.

[4] 谢黎崖, 胡权, 吴永良, 等.叶酸和聚乙二醇双修饰的壳聚糖纳米粒的制备及其性能表征.中国现代应用药学, 2013, 30(3):284-289.

[5] 刘文文, 王晓梅, 赵永波, 等.重组大鼠质粒pEGFP-GDNF的构建及真核细胞转染.中风与神经疾病杂志, 2005, 22(2):104-106.

[收稿日期:2016-03-31]

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