鱼腥草挥发油对Raji细胞增殖和凋亡的影响*

张壮丽，赵　宁，王亚飞，邹　敏，赵志鸿，张小俊，王桂芳

1)河南省医药科学研究院药化室 郑州450052　2)郑州市第六人民医院药务科 郑州 450001　3)郑州大学药学院 郑州 450001　△女，1978年1月生，博士，副研究员，研究方向：中药新药研究，E-mail：zzl7814@163.com



鱼腥草挥发油对Raji细胞增殖和凋亡的影响*

张壮丽1)△，赵宁2)，王亚飞3)，邹敏1)，赵志鸿1)，张小俊1)，王桂芳1)

1)河南省医药科学研究院药化室 郑州4500522)郑州市第六人民医院药务科 郑州 4500013)郑州大学药学院 郑州 450001△女，1978年1月生，博士，副研究员，研究方向：中药新药研究，E-mail：zzl7814@163.com

摘要目的：研究鱼腥草挥发油对Raji细胞增殖与凋亡的影响。方法：采用MTT法观察不同体积分数的鱼腥草挥发油体外诱导Raji细胞24、48和72 h对细胞增殖的影响；分别采用Annexin V-FITC/PI双染法及PI单染法检测不同体积分数的鱼腥草挥发油处理Raji细胞48 h后细胞凋亡及细胞周期的改变。结果：鱼腥草挥发油诱导Raji细胞24、48和72 h的IC50(V/V)分别为0.125 80×10-3、0.099 58×10-3和0.105 22×10-3，且随鱼腥草挥发油体积分数的增加，细胞增殖抑制率及凋亡率均呈升高的趋势(P<0.05)；细胞周期检测结果表明鱼腥草挥发油将细胞阻滞于G0/G1期。结论：鱼腥草挥发油能够显著抑制Raji细胞的增殖，诱导细胞凋亡；其作用机制可能与阻滞细胞G1/M转化有关。

非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkins lymphoma，NHL)是一组起源于淋巴结、骨髓、脾脏等淋巴组织的恶性肿瘤，其侵及范围广，早期复发，预后极差，死亡率高，近些年发病率逐渐上升[1-3]。尽管目前标准化疗对NHL的有效率较高[4]，但不良反应大，复发率高，且再治疗缓解率低，缓解时间短，损伤骨髓造血系统与免疫功能。作者所在的课题组前期研究[5]发现，鱼腥草挥发油(volatile oil from houttuyniae herba，HHO)对人Burkitt淋巴瘤Raji细胞有明显的增殖抑制作用。目前对鱼腥草抗肿瘤作用的研究多集中在鱼腥草提取物上[6-8]，对HHO抗肿瘤作用的研究较少。该研究以Raji细胞为研究对象，观察HHO对Raji细胞增殖及凋亡的影响，以期为HHO在恶性淋巴瘤治疗方面的研究与应用提供实验依据。

1材料与方法

1.1材料Raji细胞株购自中国科学院上海细胞库，HHO由作者所在的实验室采用水蒸气蒸馏法提取自鱼腥草干品(原药材购自四川江油，并经河南中医药大学药学院生药学科董诚明教授鉴定)。RPMI 1640培养基购自北京索莱宝生物医药科技有限公司，胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司，MTT购自美国Sigma公司，Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒和DNA含量检测试剂盒(细胞周期)购自南京凯基生物科技发展有限公司，顺铂注射液购自江苏豪森药业股份有限公司，注射用硫酸长春新碱(简称长春新碱)购自浙江海正药业股份有限公司。

1.2HHO溶液的配制取HHO溶于DMSO制成体积分数50%的母液，加入含体积分数10%胎牛血清的培养基,逐级稀释至目标浓度。

1.3MTT法检测细胞增殖取96孔板，设给药组、阳性对照组和阴性对照组，每孔接种对数生长期的Raji细胞混悬液100 μL，细胞数(9～10)×103/孔；给药组分别加入1.2中配制的HHO溶液100 μL，使HHO最终体积分数(10-3)分别为0.500 00、0.250 00、0.125 00、0.062 50、0.031 25；阳性对照组分别加入顺铂和长春新碱溶液各100 μL，使终质量浓度均为10 mg/L；阴性对照组加入等体积的培养基，每组均设3个复孔。将96孔板置于恒温培养箱中，于37 ℃、体积分数5% CO2条件下培养24、48 和72 h后，每孔加入5 g/L的MTT溶液20 μL，继续培养4 h后取出96孔板，3 000 r/min离心25 min， 吸弃上清，每孔加入DMSO 150 μL，置于气浴恒温振荡器中37 ℃振荡10 min，使结晶物充分溶解。使用酶联免疫检测仪在490 nm波长下检测各孔的吸光度(A)值，计算细胞增殖抑制率(1-给药组或阳性对照组A值/阴性对照组A值×100%)。再以药物浓度为横坐标，以细胞增殖抑制率为纵坐标，作剂量-效应曲线，拟合回归方程，计算药物对细胞的IC50。实验重复3次。

1.4Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡取50 mL细胞培养瓶，设置给药组和阴性对照组，每瓶接种1×106mL-1的细胞混悬液3 mL；给药组分别加入不同体积分数的HHO溶液3 mL，使药物最终体积分数(×10-3)分别为0.05、0.10、0.15、0.20；阴性对照组加入等体积的培养基。混匀后，于37 ℃、体积分数5% CO2条件下培养48 h。将各组细胞1 000 r/min离心5 min后弃去上清，PBS洗2次，收集(1～5)×105个细胞，加入500 μL的Binding Buffer重悬细胞后加入5 μL Annexin V-FITC混匀，最后加入5 μL PI，混匀、室温避光反应5～15 min。在染色后1 h 内采用流式细胞仪检测，激发波长488 nm，发射波长530 nm。计算细胞凋亡率。实验重复3次。

1.5PI单染法检测细胞周期取50 mL细胞培养瓶，设置给药组和阴性对照组，每瓶接种1×106mL-1的细胞混悬液3 mL；给药组分别加入不同体积分数的HHO溶液3 mL，使药物最终体积分数(×10-3)分别为0.05、0.10、0.15；阴性对照组加入等体积的培养基。混匀后于37 ℃、体积分数5% CO2条件下培养48 h。将各组细胞1 000 r/min离心5 min后弃去上清，PBS洗1次，收集并调整细胞密度为1×106mL-1；取1 mL单细胞悬液，离心去上清后，向细胞中加入体积分数为70%的冷乙醇500 μL，4 ℃固定过夜并保存。将固定后的细胞1 000 r/min离心5 min后弃去上清，PBS洗1次，加100 μL的RNase A重悬后，37 ℃水浴30 min，再加入400 μL PI染液混匀，4 ℃避光30 min。将染色后的细胞上机检测，记录激发波长488 nm处的红色荧光，分析细胞周期分布情况。实验重复3次。

1.6统计学处理采用SPSS 21.0处理数据。采用单因素方差分析比较不同组间细胞增殖抑制率、细胞凋亡率以及细胞周期分布的差异，两两比较采用LSD-t检验，检验水准α=0.05。

2结果

2.1HHO对Raji细胞增殖的影响见表1。HHO作用24、48和72 h对Raji细胞的IC50(体积分数/×10-3)分别为0.125 80、0.099 58和0.105 22。作用时间相同时，在一定范围(体积分数≤0.250 00×10-3)内，随HHO体积分数的增加，细胞增殖抑制率呈升高的趋势。

表1　各组Raji细胞的增殖抑制率(n=3)　%

2.2HHO对Raji细胞凋亡的影响体积分数(×10-3)分别为0.00(阴性对照组)、0.05、0.10、0.15和0.20的HHO诱导Raji细胞48 h的凋亡率分别为(3.27±0.74)%、(13.10±0.82)%、(33.33±3.50)%、(55.53±0.90)%和(75.23±0.87)%，随着HHO体积分数的增加，细胞凋亡率呈升高的趋势(F=878.629，P<0.001)。

2.3HHO对Raji细胞周期的影响见表2。随HHO体积分数的增加，Raji细胞G0/G1期细胞比例有升高的趋势，S期和G2/M期细胞比例则呈降低的趋势。

表2　HHO诱导48 h对Raji细胞周期的影响(n=3)　%

3讨论

淋巴瘤是我国常见的十大恶性肿瘤之一，每年新发淋巴瘤患者约8.4万，死亡人数超过4.7万，并以每年5%的速度上升，其中约九成患者罹患NHL，其恶性程度更高，预后更差。目前常用的化疗药物虽治疗效果明显，但常伴有严重的不良反应[9-10]。

与普通化疗药相比，中药多成分多靶点，可以作用于肿瘤发病的不同环节[11-12]，并且具有毒性低、不易产生耐药、可提高机体免疫力、使患者生存质量更高等特点，近年来在抗肿瘤新药开发领域，具有抗肿瘤作用的中药及其有效成分得到了越来越多的关注。

鱼腥草为三白草科蕺菜属植物蕺菜的新鲜全草或干燥地上部分，味辛，性微寒，归肺经，有清热解毒、消痈排脓、利尿通淋等功效[13]。作者所在的实验组采用水蒸气蒸馏法提取HHO并优化了提取工艺[14]，采用气-质联用技术从HHO中分离鉴定出29个主成分，并利用偏最小二乘回归分析法对不同产地HHO GC-MS特征峰与Raji细胞增殖抑制率进行了谱效关系分析，结果表明HHO抗淋巴瘤的有效成分组包括对伞花烃、(-)-4-萜品醇、2,4,6-三甲基苯甲醇、甲基正壬酮、十一醇、正癸酸、乙酸香叶酯、2-十二烷酮和石竹烯，其对Raji细胞的抑制作用应为这些物质协同作用的结果[15]。

该研究结果表明，HHO能够有效抑制Raji细胞的增殖，诱导细胞凋亡，填补了HHO抗肿瘤研究方面的空白，为其在治疗NHL方面的研究及应用提供了参考。细胞周期检测结果显示，Raji细胞经HHO处理后细胞周期被阻滞于G0/G1期，提示HHO诱导Raji细胞凋亡的机制可能与阻滞细胞周期G1/M转化、抑制细胞中DNA合成和有丝分裂有关，然而细胞周期调控机制涉及多个环节[16-18]，HHO具体作用于哪些环节，还需进一步探索研究。

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(2015-10-16收稿责任编辑徐春燕)

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2016.04.010

中图分类号R965

关键词鱼腥草挥发油；Raji细胞；凋亡；细胞周期

Effect of volatile oil from houttuyniae herba on proliferation and apoptosis of Raji cells

ZHANG Zhuangli1)，ZHAO Ning2)，WANG Yafei3)，ZOU Min1)，ZHAO Zhihong1)，ZHANG Xiaojun1)，WANG Guifang1)

1)MedicinalChemistrySection,HenanAcademyofMedicalandPharmaceuticalSciences,Zhengzhou4500522)DepartmentofMedicineServices,theSixthPeople′sHospitalofZhengzhou,Zhengzhou4500013)CollegeofPharmaceuticalSciences,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001

Key wordsvolatile oil from houttuyniae herba；Raji cell；apoptosis；cell cycle

AbstractAim: To investigate the effect of volatile oil from houttuyniae herba(HHO) on the proliferation and apoptosis of Raji cells.Methods: Different volume fraction of HHO was used to treat Raji cells for 24，48 and 72 h;the prolifera tion of Raji cells was determined by MTT assay.Different volume fraction of HHO was used to treat Raji cells for 48 h; the cell apoptosis rate was measured by Annexin V-FITC/PI double staining method，and the cell cycle was observed by PI staining method.Results: The MTT results showed that IC50(V/V) of HHO for 24，48 and 72 h treatment was 0.125 80×10-3，0.099 58×10-3and 0.105 22×10-3；with the increase of volume fraction，the inhibitory effect and apoptosis rate showed a rising trend(P<0.05).The results of cell cycle detection showed that HHO was able to arrest Raji cells in G0/G1 phase.Conclusion: HHO could significantly inhibit the proliferation of Raji cells and induce cell apoptosis,and the mechanism may be related to HHO′s blocking G1/M conversion of Raji cells.

*河南省重点科技攻关计划项目142102310433；河南省自然科学基金资助项目152300410159；河南省省属科研单位社会公益项目预研专项2013，2014

*：与顺铂组和长春新碱组比较，P<0.05；#：不同体积分数的HHO组间除0.250 00×10-3和0.500 00×10-3组外，其他组间两两比较，P均<0.05。

*：与阴性对照组比较，P<0.05；#：与0.05×10-3HHO组相比，P<0.05；△：与0.10×10-3HHO组相比，P<0.05。