4.1R基因敲除小鼠血液生理生化参数分析*

禹丽娜,李建辉，张丽果，宁姝威，薛超越，范丹丹，杨小静，裘一兵，康巧珍，汲振余#

1)河南省医药科学研究院肿瘤病理科 郑州 450052　2)郑州市中心医院消化内科 郑州 450000　3)郑州大学生命科学学院 郑州 450001



4.1R基因敲除小鼠血液生理生化参数分析*

禹丽娜1,2),李建辉1,3)，张丽果1)，宁姝威1,3)，薛超越1,3)，范丹丹1)，杨小静1)，裘一兵1)，康巧珍3)，汲振余1)#

1)河南省医药科学研究院肿瘤病理科 郑州 4500522)郑州市中心医院消化内科 郑州 4500003)郑州大学生命科学学院 郑州 450001

摘要目的：检测并分析蛋白4.1R基因敲除小鼠(4.1R-/-)和野生型小鼠(4.1R+/+)血液生理生化参数。方法：摘眼球法采集两组小鼠(n=6)血液，用全自动血液细胞分析仪和生化分析仪检测血液生理生化参数。结果：血液生理参数中，4.1R-/-小鼠红细胞计数、血红蛋白、红细胞压积和中性粒细胞比率显著低于野生型小鼠(P<0.05)；血小板计数、平均血小板体积、血小板压积、白细胞计数、淋巴细胞比率显著高于野生型小鼠(P<0.05)。生化参数中，4.1R-/-小鼠碱性磷酸酶显著低于野生型小鼠，总胆红素、直接胆红素和间接胆红素显著高于野生型小鼠(P<0.05)。结论：蛋白4.1R缺失可导致慢性溶血性贫血，4.1R-/-小鼠相关血液生理生化参数随之改变。

蛋白4.1R是最初发现于成熟红细胞中的细胞膜骨架蛋白分子，是红细胞膜骨架的一个基本成分[1]，有相对分子质量为80 000、135 000两种亚型[2]。目前，该蛋白在红细胞中的功能研究比较透彻，但在有核细胞中的功能还不清楚。4.1R蛋白缺乏会降低有核细胞E-钙黏蛋白与肌动蛋白细胞骨架的结合能力并破坏细胞与细胞之间的接触[3]，影响角质细胞的扩散和迁移[4]。CD4+T淋巴细胞中4.1R蛋白能与L型氨基酸转运体(L-type amino acid transporter,LAT)结合并抑制ZAP-70对LAT的磷酸化，负调控CD4+T淋巴细胞的活化[5]。为进一步研究蛋白4.1R在T细胞中的功能，作者从美国纽约血液中心引进并建立了4.1R基因敲除(4.1R-/-)小鼠模型，对其血液生理和生化参数进行了测定，以丰富4.1R-/-小鼠模型相关资料，为后续研究与应用提供基础。

1材料与方法

1.1实验动物4.1R-/-小鼠与4.1R+/+野生型小鼠，遗传背景为C57BL/6，SPF级，均来自该实验室。小鼠按SPF级标准饲养于IVC-Ⅱ型独立送风隔离笼具中。环境温度20～25 ℃，湿度40%～60%，照明12 h亮暗交替，空气洁净度1万级。饮水为经高温高压蒸汽灭菌的蒸馏水，饲料为河南省实验动物中心提供的经钴60照射灭菌的SPF级饲料。

1.2小鼠基因型鉴定随机选取8周龄4.1R-/-小鼠与4.1R+/+小鼠各6只，取肝脏，研磨提取RNA反转录(42 ℃ 60 min，70 ℃ 5 min)，之后进行PCR扩增，反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，62 ℃退火30 s，72 ℃ 延伸2 min，30个循环。4.1R引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成，正向引物1序列：5’-ATGACAACAGAGAAGAGTTTAGTG GCTGAAGC-3’，正向引物2序列：5’-ATGCACTGTA AGGTCTCCTTGTTGGATGACACG-3’，共同反向引物序列：5’-CTCCTCAGAGATCTCTGTCTCCTGGTGGA-3’。产物用10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测，扩增出1 700 bp与2 500 bp片段的为4.1R+/+小鼠，无扩增片段的为4.1R-/-小鼠。

1.3血液生理参数检测取8周龄 4.1R-/-小鼠与4.1R+/+小鼠各6只，空腹12 h，摘除眼球法取血，每只取血0.8 mL左右，装入2 mL加有抗凝剂的采血管中，使用全自动血液分析仪(Pentra80，法国ABX公司)检测血液生理参数[6]。

1.4生化参数检测取8周龄4.1R-/-小鼠与4.1R+/+小鼠各6只，空腹12 h，摘除眼球法取血，每只取血0.8 mL左右，收集入未加抗凝剂的采血管中，室温静置30 min后，3 000 r/min离心10 min，分离血清。使用全自动生化分析仪(BT2000Plus，意大利)检测血液生化参数[7]。

1.5统计学处理采用SPSS 19.0进行统计分析，两组小鼠血液生理生化参数的比较采用两独立样本t检验，检验水准α=0.05。

2结果

2.1小鼠基因型鉴定PCR扩增后，4.1R+/+小鼠成功扩增出2条条带，大小分别为1 700 bp与2 500 bp，而4.1R-/-小鼠没有扩增出相应条带，表现为完全缺失(图1)。

2.2两组小鼠血液生理参数的比较见表1。4.1R-/-小鼠红细胞计数(RBC)、血红蛋白(HGB)、红细胞压积(HCT)和中性粒细胞比率(NEU)低于4.1R+/+小鼠(P<0.01)，而血小板计数(PLT)、平均血小板体积(MPV)、血小板压积(PCT)、白细胞计数(WBC)和淋巴细胞比率(LYM)高于4.1R+/+小鼠(P<0.05)。二者的单核细胞比率(MON)、嗜酸性粒细胞比率(EOS)、嗜碱性粒细胞比率(BAS)、异淋巴细胞百分比(ALY)、巨大不成熟细胞百分比(LIC)差异无统计学意义。

表1　两组小鼠血液生理参数的比较

2.3两组小鼠血液生化参数的比较见表2。4.1R-/-小鼠碱性磷酸酶(ALP)水平低于4.1R+/+小鼠(P<0.05)；总胆红素(T-BIL)、直接胆红素(D-BIL)和间接胆红素(I-BIL)水平高于4.1R+/+小鼠(P<0.05)。二者的谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLO)、尿素氮(BUN)、肌酐(Cre)差异无统计学意义。

表2　两组小鼠血液生化参数的比较

3讨论

蛋白4.1R在红细胞膜上一端连接跨膜蛋白，一端连接血影蛋白-肌动蛋白骨架，对维持红细胞的形状、黏附、脆性及正常生理功能具有重要作用[8]。4.1R基因敲除会引起红细胞的畸形以及溶血[9-10]。蛋白4.1R缺失会导致人类红细胞呈椭圆形，而4.1R-/-小鼠红细胞更多地呈现为球形[11]。该实验中作者对实验小鼠的基因型进行了鉴定，确定了小鼠的基因型，4.1R-/-小鼠具有稳定的遗传特性。作者在400倍显微镜下观察，并未发现4.1R+/+小鼠与4.1R-/-小鼠血涂片有异常。小鼠血液生理生化参数检测结果显示，4.1R-/-小鼠血液中HGB水平低于4.1R+/+小鼠。一般来说，动物血液中HGB含量越多，红细胞最大脆性越小[12]。因此，4.1R-/-小鼠红细胞最大脆性大于4.1R+/+小鼠，相应地其抗张力和变形能力降低，故具有易溶血倾向。变形能力差的红细胞不易或不能通过直径比它小很多的脾窦微循环，而阻留在脾脏内，被巨噬细胞破坏。肝脏也可清除改变显著的异常红细胞。较大量血管外溶血时，胆红素与葡萄糖醛酸不能及时结合，血液中I-BIL含量升高，可能会出现黄疸。在小鼠血液生化参数检测中发现，4.1R-/-小鼠血液中I-BIL含量偏高。据此判断，蛋白4.1R缺失小鼠红细胞易出现溶血。长期的慢性溶血使得4.1R-/-小鼠发生贫血现象，造成RBC降低，HCT变小，PLT升高，肝功能指标ALP降低。

研究[11]显示，蛋白4.1R缺失后，小鼠CD8+T淋巴细胞细胞周期缩短，增殖能力变强。该研究中，血液生化实验检测结果显示4.1R-/-小鼠血液中WBC减少，其中LYM偏高，NEU偏低，此现象与蛋白4.1R在CD8+T淋巴细胞中的功能是否具有相关性还有待进一步研究。

虽然4.1R-/-小鼠易发生慢性溶血性贫血，但是在SPF饲养条件下，其与4.1R+/+小鼠相比在外观形态、体重、日常活动等方面并无明显差异。4.1R-/-小鼠也具有正常的生存能力和生育能力，因此是研究蛋白4.1R功能的有效动物模型。4.1R-/-小鼠血液生理生化参数指标系统的建立，为研究蛋白4.1R在红细胞发育、T淋巴细胞功能及相关疾病中的作用提供了基础资料。

参考文献

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[2]BAZZINI C,BENEDETTI L,CIVELLO D,et al.ICln: a new regulator of non-erythroid 4.1R localisation and function[J].PLoS One,2014,9(10):e108826

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[5]KANG Q,YU Y,PEI X,et al.Cytoskeletal protein 4.1R negatively regulates T-cell activation by inhibiting the phosphorylation of LAT[J].Blood,2009,113(24):6128

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[11]GAUTHIER E,GUO X,MOHANDAS N,et al.Phosphorylation-dependent perturbations of the 4.1R-associated multiprotein complex of the erythrocyte membrane[J].Biochemistry,2011,50(21):4561

[12]王杨科,毛治彦,李丽霞.黄鳝血液生理参数的研究[J].氨基酸和生物资源,2002,24(1):7

(2015-10-14收稿责任编辑王曼)

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2016.04.008

#通信作者，男，1965年8月生，博士，研究员，研究方向：蛋白功能与肿瘤，E-mail:jizhenyu@zzu.edu.cn

中图分类号R-332

关键词4.1R；血液生理生化参数；溶血性贫血；小鼠

Analysis on blood physiological and biochemical parameters of 4.1R gene knockout mice

YU Lina1,2),LI Jianhui1,3)，ZHANG Liguo1)，NING Shuwei1,3)，XUE Chaoyue1,3)，FAN Dandan1),YANG Xiaojing1)，QIU Yibing1)，KANG Qiaozhen3), JI Zhenyu1)

1)DepartmentofTumorPathology,HenanInstituteofPharmaceuticalScience,Zhengzhou450052 2)DepartmentofGastroenterology,ZhengzhouCentralHospital,Zhengzhou4500003)SchoolofLifeScience,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001

Key wordsprotein 4.1R；blood physiological and biochemical parameter；hemolytic anemia；mouse

AbstractAim: To detect and analyze blood physiological and biochemical parameters of 4.1R gene knockout mice(4.1R-/-) and wild-type (4.1R+/+) mice. Methods: Blood samples of 4.1R-/-mice and wild-type mice were collected by enucleating of eyeball, followed by blood physiological and biochemical parameters testing with automatic blood cell analyzer and biochemical analyzer. Results: Compared with those of the wild-type mice,RBC, HGB, HCT,and NEU of 4.1R-/-mice were obviously lower(P<0.05);while PLT,MPV,PCT,WBC and LYM of 4.1R-/-mice were obviously higher(P<0.05). ALP,one of biochemical parameters, was significantly lower,while T-BIL, D-BIL and I-BIL of 4.1R-/-mice were significantly higher(P<0.05). Conclusion: Deletion of protein 4.1R might result in chronic hemolytic anemia, and changes of blood physiological and biochemical parameters may be basic information for the further study with 4.1R-/-mice model.

*国家自然科学基金资助项目81172784,30972707