RP-HPLC法同时测定酶法合成阿莫西林工艺中的原料、中间体和产物的含量*

李永红，周方方，付路平，冯利菲,刘宏民#

1)郑州大学药学院 郑州 450001　2)郑州大学新药研究开发中心 郑州 450001



RP-HPLC法同时测定酶法合成阿莫西林工艺中的原料、中间体和产物的含量*

李永红1,2)，周方方1,2)，付路平1,2)，冯利菲1,2),刘宏民1,2)#

1)郑州大学药学院 郑州 4500012)郑州大学新药研究开发中心 郑州 450001

摘要目的：建立同时测定酶法合成阿莫西林反应体系中原料、中间体和产物含量的反相高效液相分析方法。方法：以 Gemini-NX-C18为固定相；甲醇0.05 mol/L、pH 5.6的磷酸盐缓冲液(V�V)为流动相；流速1.0 mL/min；检测波长230 nm；进样量10 μL；柱温30 ℃进行检测。 结果：6-氨基青霉烷酸、D-对羟基苯甘氨酸甲酯、D-对羟基苯甘氨酸、阿莫西林在各自的线性条件内线性关系良好，最低检测限分别为4.00、1.00、0.04、1.00 mg/L。结论：该方法准确灵敏，适合同时测定酶法合成阿莫西林反应体系中原料、中间体和产物的含量。

阿莫西林(AMO)具有高效广谱抗菌作用,而且不良反应很少， WHO推荐其作为首选的β-内酰胺类口服抗生素。工业上生产AMO通常用化学方法，步骤繁琐，条件苛刻，而且污染严重。随着人类环保意识逐渐增强，酶法合成β-内酰胺抗生素已经变得越来越受人关注[1]。目前，酶法合成AMO工艺已经比较成熟，转化率也较高[2-4]。 采用一锅法[5-6]，6-氨基青霉烷酸(6-APA)[7]和D-对羟基苯甘氨酸甲酯(HPGM)2种原料在青霉素酰化酶[8]的催化下直接生成了产物AMO[9]。在反应的过程中，一部分HPGM会水解生成D-对羟基苯甘氨酸(HPG)。生成的产物AMO也可能发生水解反应，水解产物是HPG、6-APA和甲醇，故酶促反应体系中6-APA、HPGM、HPG、AMO 4种物质共存。虽然有测定HPG[10]、6-APA[11]和AMO[12-13]的HPLC方法，但是未见到用RP-HPLC法同时检测这4种物质含量的报道，作者对此进行了研究，现将结果报道如下。

1材料与方法

1.1仪器与试剂1200 HPLC仪、紫外检测器(安捷伦科技有限公司)，Gemini-NX-C18型色谱柱(广州菲罗门科技有限公司)，HYG-Ⅱa 型自动摇瓶柜(上海欣蕊自动化设备有限公司)，SHZ-D(Ⅲ)型真空泵(郑州凯鹏实验仪器有限公司)，雷磁pHS-3C型酸度计(济南东仪实验室设备有限公司)，青霉素酰化酶(湖南福来格生物有限公司)，HPGM(纯度97%，Ark Pharm Inc公司产品)，6-APA、HPG(纯度99.4%)及AMO(纯度85.8%)均购自中国药品生物制品鉴定所，甲醇为色谱纯，其他试剂均为分析纯。

1.2样品和标准样品的制备及RP-HPLC测定标准样品的制备：分别精确称取相应的标准品于容量瓶中，严格用相应的流动相溶解，配制成一系列的储备液。各储备液经过适当稀释后，分别配制成单标溶液用于定性分析。再分别精密称取相应的对照品，配制成一系列浓度的混合标准溶液，用于制作标准曲线、精密度及回收率等相关实验。

样品的制备：在28 ℃、180 r/min条件下加入相应的青霉素酰化酶和异辛醇，1 h后酶充分分散。采用一锅法加入HPGM和6-APA，反应11 h后，旋转蒸发仪蒸干，再用相应的流动相溶解，0.45 μm微孔滤膜过滤后，用RP-HPLC法检测体系中各物质的含量[14]。

根据6-APA和HPGM的分子结构、解离常数，HPGM易水解等性质，pH值对6-APA和HPGM的分离影响最大，以这2种化合物为主要研究对象，选择3种不同pH值(5.0、5.6、6.0)的流动相对同一样品分别进行测定[15-16]。实验重复5次。

分别配制浓度为0.02、0.05和1.00 mol/L的磷酸盐缓冲溶液，依次进样，以塔板数、对称因子、分离度为主要指标进行筛选。

由于6-APA和AMO 2种化合物的保留时间很接近，故选用不同的流动相配比使这2种化合物的分离度达到中国药典要求。选择甲醇和0.05 mol/L、pH值为5.6的磷酸盐缓冲液做流动相，采用不同的流动相比例，对同一样品进行测定，以确定最佳的流动相比例。实验重复5次。

分别设置柱温箱的温度为25、30、35和40 ℃，依次进样，以塔板数、对称因子、分离度为主要指标进行筛选。

取不同浓度的混合标准溶液，用HPLC色谱图峰面积对混合标准溶液浓度进行线性回归和检测限分析。

在酶法合成AMO反应体系中加入一系列的混合标准溶液，按照上述方法处理后进行加样回收率分析。

2结果

2.1磷酸盐缓冲溶液pH值的确定结果见表1。由表1可以看出，当pH值为5.6时，分离完全。因此流动相的pH值确定为5.6。

表1　流动相pH值对保留时间的影响(n=5)　min

2.2磷酸盐缓冲溶液浓度的确定对不同浓度梯度的磷酸盐缓冲溶液进行进样分析，最终确定最适宜的流动相浓度为0.05 mol/L。

表2　流动相配比对分离度的影响(n=5)

2.4温度的确定对不同的柱温箱温度进行进样分析，最终确定柱温箱的温度为30 ℃。

2.5色谱图以上述优化的反应条件，对转化液进样，色谱图见图1。

2.6标准曲线和检测限结果见表3。由表3可知，4种化合物在各自的浓度范围内线性关系良好。6-APA、HPGM、HPG、AMO的最低检测限分别为4.00、1.00、0.04、1.00 mg/L。

从左至右依次为化合物HPG、6-APA、AMO及HPGM的色谱峰。图1　转化液的色谱图

化合物线性方程6-APAY=2.6683X+0.026670HPGMY=15.664X-12.337HPGY=71.687X-90.802AMOY=14.280X+5.6919

2.7加样回收率结果见表4。6-APA、HPGM、HPG、AMO的平均回收率分别为99.77%、99.47%、99.97%、98.90%，相对标准偏差分别为1.32%、1.49%、1.72%、1.31%。4种化合物的平均回收率和相对标准偏差均在误差范围内，结果可信。

表4　加样回收率结果

3讨论

作者利用此分析方法已经对酶法合成AMO的工艺条件进行了优化，主要包括酶解时间、温度、酸碱度及底物浓度等条件。经过优化后，转化效率提高了80%，成本大大降低。

参考文献

[1]孟昭伟.异辛醇中酶法合成阿莫西林的工艺研究[D].北京:北京化工大学,2009.

[2]韦晓菊.合成用青霉素酰化酶的发酵与酶法合成头孢克洛[D].长沙:中南林业科技大学, 2014.

[3]丛军.酶法制备阿莫西林的工艺优化研究[J].黑龙江科技信息,2015(3):14

[4]ZHANG YW,LIU RJ,XU XM.One-pot, two-step enzymatic synthesis of amoxicillin by complexing with Zn2+[J].Appl Microbiol Biotechnol,2010,88(1):49

[5]WU Q,CHEN CX,DU LL,et al.Enzymatic synthesis of amoxicillin via a one-pot enzymatic hydrolysis and condensation cascade process in the presence of organic co-solvents[J].Appl Biochem Biotechnol,2010,160(7):2026

[6]陈春秀.有机介质中酶促高效合成阿莫西林及其一锅法研究[D].杭州:浙江大学,2008.

[7]GONCALVES LR,FERNANDEZ-LAFUENTE R,GUISAN JM,et al.The role of 6-aminopenicillanic acid on the kinetics of amoxicillin enzymatic synthesis catalyzed by penicillin G acylase immobilized onto glyoxyl-agarose[J].Enzyme Microb Technol,2002,31:464

[8]PEREIRA SC,BUSSAMARA R,MARIN GA,et al.Enzymatic synthesis of amoxicillin by penicillin G acylase in the presence of ionic liquids[J].Green Chem,2012,14(11):3146

[9]GONCALVES LR,SOUSA R,FERNANDEZ-LAFUENTE R,et al.Enzymatic synthesis of amoxicillin:avoiding limitations of the mechanistic approach for reaction kinetics[J].Biotechnol Bioeng,2002,80(6):622

[10]宋慧敏,屠春燕,欧阳平凯.高效液相色谱法测定D-对羟基苯甘氨酸[J].南京工业大学学报(自然科学版),2002,24(4):97

[11]周光邠,洪肇琳.测定青霉素发酵液中6-APA含量的简速方法[J].抗生素,1981,3(3):42

[12]陈玮,苏克剑,孙黎.HPLC法测定阿莫西林含量的测量不确定度评估[J].中国药房,2011，22(20):1910

[13]李彦威,勾洪磊,杨秀花,等.反相高效液相色谱法测定阿莫西林[J].理化检验:化学分册,2008,44(3):216

[14]李永红,王瑞,孙志浩.RP-HPLC方法同时测定生物转化液中的香草醛和异丁香酚含量[J].河南工业大学学报(自然科学版),2007,28(5):50

[15]OSPINA S,BARZANA E,RAMREZ OT,et al.Effect of pH in the synthesis of ampicillin by penicillin acylase[J].Enzyme Microb Technol,1996,19:462

[16]李永红,于梅艳,刘宏民.高效液相色谱法测定β-氨基醇类药物中间体的含量及ee值[J].郑州大学学报(医学版),2009,44(2):427

(2015-10-14收稿责任编辑姜春霞)

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2016.04.005

#通信作者，男，1960年3月生，博士，教授，研究方向：药物化学及糖化学，E-mail：liuhm@zzu.edu.cn

中图分类号TQ460.7

关键词阿莫西林；中间体；反相高效液相色谱法；酶法合成

Simultaneous determination of content of raw materials，intermediates， and products in process of enzymatic synthesis of amoxicillin by RP-HPLC

LI Yonghong1,2),ZHOU Fangfang1,2),FU Luping1,2)，FENG Lifei1,2),LIU Hongmin1,2)

1)DepartmentofPharmaceuticalSciences,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou4500012)NewDrugResearch&DevelopmentCenter，ZhengzhouUniversity，Zhengzhou450001

Key wordsamoxicillin;intermediate;RP-HPLC;enzymatic synthesis

AbstractAim: To establish a RP-HPLC method to simultaneously determine the content of raw materials, intermediates, and products in the process of enzymatic synthesis of amoxicillin.Methods: The determination was performed on a Gemini-NX-C18 column with a 90 mixture of methanol and phosphate buffer solution(0.05 mol/L, pH 5.6) as mobile phase, 1.0 mL/min as flow rate, 230 nm as determination wavelength, and 10 μL as injection volume with column temperature of 30 ℃.Results: The content of 6-APA, HPGM, HPG, and amoxicillin had good linear relationship in certain range and the limits of the detection were 4.00, 1.00, 0.04, and 1.00 mg/L, respectively. Conclusion: The method is accurate, sensitive and suitable to simultaneously determine the content of raw materials, intermediates, and products in the process of enzymatic synthesis of amoxicillin.

*国家自然科学基金资助项目21402178