冬枣多糖的分离纯化及抗氧化活性研究

潘 莹，许经伟（.滨州职业学院生物工程系，山东 滨州 56603；.滨州学院资源环境系，山东 滨州 56603）



冬枣多糖的分离纯化及抗氧化活性研究

潘 莹1，许经伟2
（1.滨州职业学院生物工程系，山东 滨州 256603；2.滨州学院资源环境系，山东 滨州 256603）

摘 要：目的：分离纯化冬枣多糖，并研究其组分、结构特征和抗氧化活性。方法：采用水提醇沉、脱蛋白脱色、DEAE-52纤维素柱和Sephadex G-100凝胶色谱柱分离纯化冬枣多糖；利用Sephadex G-100凝胶色谱柱进行纯度鉴定和分子质量的测定；通过紫外光谱、红外光谱、气相色谱法进行了初步结构分析；采用邻二氮菲法和1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）体系对纯化多糖进行抗氧化活性的研究。结果：冬枣多糖经DEAE-52分离和Sephadex G-100纯化得到2 个组分DPA和DPB，经Sephadex G-100鉴定均为均一组分，DPA和DPB分子质量分别为1.04×104、3.02×105D，不含蛋白质和核酸，为吡喃型糖苷环骨架，DPA的单糖组成为阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖，其物质的量比为6.66∶1.00∶6.75∶2.09；DPB的单糖组成为鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖，其物质的量比为4.33∶10.90∶1.00∶3.25∶4.78；DPA和DPB均具有一定的抗氧化活性，随着多糖质量浓度的增加，其抗氧化活性增强，在质量浓度为8 mg/mL时对羟自由基清除率分别为28.52%、78.79%，在质量浓度为0.4 mg/mL时对DPPH自由基清除率分别为9.97%、24.54%。结论：DPA和DPB均具有一定的抗氧化活性。

关键词：冬枣；多糖；分离纯化；结构鉴定；抗氧化活性

引文格式：

潘莹， 许经伟.冬枣多糖的分离纯化及抗氧化活性研究［J］.食品科学， 2016， 37（13）: 89-94.DOI:10.7506/spkx1002-6630-201613016. http://www.spkx.net.cn

PAN Ying， XU Jingwei.Isolation， purification and antioxidant activity of polysaccharides from Zizyphus jujube cv.Dongzao［J］.Food Science， 2016， 37（13）: 89-94.（in Chinese with English abstract） DOI:10.7506/spkx1002-6630-201613016. http://www.spkx.net.cn

冬枣（Zizyphus jujube cv.Dongzao）为鼠李科枣属植物，为我国特有的一种晚熟鲜食枣。由于冬枣果肉脆嫩多汁，富含人体所需的氨基酸、维生素和微量元素，备受人们喜爱［1］。

近年来植物多糖成了人们研究的热点，关于多糖的分离纯化［2-4］及活性如抗肿瘤、抗衰老、免疫调节、抗氧化等［5］研究较多，有文献报道冬枣中糖分含量很高，且随着成熟度的增加，多糖含量也有所增加［1］，冬枣多糖物质已逐渐引起了人们的关注。

目前国内外有关冬枣的研究报道，主要集中在枣树的栽培管理、果实的贮藏与加工、病虫害防治等方面［6-7］，本研究在前期提取工艺［8］和脱蛋白工艺［9］优化的基础上，进一步对冬枣多糖进行脱色，采用DEAE-52分离和Sephadex G-100纯化得到2 个组分，并对其采用凝胶色谱法、紫外光谱法、红外光谱法、气相色谱法进行了纯度鉴定、分子质量测定、光谱特征、单糖组成等基本特征研究，还测定纯化多糖的抗氧化活性，以期为开发天然抗氧剂和冬枣多糖的综合利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

冬枣 山东省沾化县市售。

DEAE-52、葡聚糖T10、T20、T40、T70、T500、蓝色葡聚糖2000 瑞典Phamacia公司；木瓜蛋白酶（3×107U/g）、L-阿拉伯糖 美国Sigma公司；Sephadex G-100、L-鼠李糖、葡萄糖、D-甘露糖、D-半乳糖、透析袋（截留分子质量3 500 D） 上海蓝季生物科技有限公司；D-半乳糖醛酸 上海源叶生物科技有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH） 上海伊卡生物技术有限公司；粉末状活性炭 巩义市元亨净水材料厂；LS-850树脂 陕西蓝深特种树脂有限公司；AB-8型树脂、D-101型树脂 安徽三星树脂科技有限公司；无水乙醇、丙酮、浓硫酸、苯酚、氯化钠、氢氧化钠、盐酸、三氟乙酸、盐酸羟胺、乙酸酐、肌醇、磷酸二氢钾、抗坏血酸（VC）、邻二氮菲、硫酸亚铁、过氧化氢（H2O2）均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

FR224CN 电子分析天平 奥豪斯仪器有限公司；ZD-85气浴恒温振荡器 金坛市国旺实验仪器厂；TH-500A梯度混合器、BT1-100恒流泵、SBS-100-LCD数控计滴自动部分收集器 上海琪特分析仪器有限公司；TU-1810紫外-可见分光光度计 北京普析通用仪器有限公司；RE-52AAA型旋转蒸发器 上海嘉鹏科技有限公司；FL9720气相色谱仪 浙江福立分析仪器有限公司；Nicolet 380傅里叶红外光谱仪 美国Nicolet公司；MD200氮吹仪 金坛市盛蓝仪器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 冬枣多糖的提取和脱蛋白

冬枣60 ℃烘干后粉碎过60 目筛，在100 ℃按料液比1∶25（m/V）提取4 h，离心后减压浓缩，并用无水乙醇于4 ℃静置过夜，所得沉淀依次用无水乙醇和丙酮洗涤，并经真空干燥得冬枣粗多糖。

将冬枣粗多糖配成1 g/100 mL溶液，先在40 ℃条件下用450 U/mL木瓜蛋白酶酶解1.5 h后，采用9 g/100 mL三氯乙酸脱蛋白，再用1 g/100 mL氢氧化钠调pH值至7.0，得脱蛋白冬枣多糖。

1.3.2 冬枣多糖的脱色

脱蛋白冬枣多糖液为橙黄色，在400～780 nm波长范围内扫描发现其无最大吸收峰，根据溶液的互补色，选择在420 nm波长处测定其吸光度，并按公式（1）计算脱色率。多糖含量采用苯酚-硫酸法［15］测定，其多糖保留率的计算见公式（2）。

1.3.2.1 活性炭脱色［10］

取步骤1.3.1节中脱蛋白冬枣多糖液，按照1 g/100 mL的量向其中加入活性炭，于40 ℃、125 r/min条件下恒温振荡40 min，过滤，取滤液稀释后测定多糖脱色率和多糖保留率。

1.3.2.2 树脂脱色［11］

采用静态吸附法，将预处理好的AB-8、D-101、LS-850树脂，树脂与脱蛋白多糖液按0.75∶10（m/V）的比例在125 r/min常温条件下振荡2.5 h，过滤后取滤液稀释定容到25 mL后测定多糖脱色率和多糖保留率。

1.3.3 冬枣多糖的分离和纯化

将脱蛋白脱色多糖液配成100 mg/3 mL的溶液，取3 mL上样于预先平衡好的DEAE-52纤维素柱（2.6 cm×30 cm），依次用蒸馏水、0.2、0.3、0.5、1 mol/L的NaCl溶液洗脱［12-13］，流速为1 mL/min，以每管5 mL收集洗脱液，用苯酚-硫酸法［14］于490 nm波长处隔管检测，合并各吸收的洗脱液，经减压浓缩装入透析袋，在流动水和蒸馏水中分别透析48 h和24 h后上样于Sephadex G-100凝胶色谱柱（1.6 cm×40 cm），用蒸馏水洗脱，以每管1.5 mL收集洗脱液，用苯酚-硫酸法逐管检测，合并各吸收的洗脱液，经减压浓缩和真空干燥得2 种冬枣纯化后多糖，分别记为DPA和DPB。

1.3.4 冬枣多糖组分的纯度及分子质量

采用凝胶色谱法测定冬枣多糖的纯度及分子质量［15］。将标准葡聚糖T10、T20、T40、T70、T500、冬枣多糖DPA和DPB分别上样于Sephadex G-100凝胶色谱柱，用蒸馏水洗脱，流速为0.3 mL/min，以每管1.5 mL收集洗脱液，用苯酚-硫酸法逐管检测，记录不同相对分子质量的多糖经过凝胶柱的洗脱体积（Ve）和用蓝色葡聚糖-2000上柱求得柱的外水体积（V0），以Ve/V0为纵坐标，lgMw为横坐标，计算曲线方程，并绘制冬枣多糖洗脱曲线，根据洗脱曲线判断多糖纯度是否均一。

1.3.5 光谱分析

1.3.5.1 紫外光谱分析

将冬枣多糖DPA和DPB粉末分别配制成1 mg/mL的溶液，在200～700 nm波长范围内扫描，观察其在260、280 nm波长处有无吸收峰。

1.3.5.2 红外光谱分析［16］

将1 mg干燥的冬枣多糖DPA和DPB粉末分别与100 mg KBr固体粉末在玛瑙研钵中研磨均匀，用压片机压成薄片，在4 000～400 cm－1范围内进行红外光谱扫描。

1.3.6 理化性质分析

1.3.6.1 显色反应［16］

将2 种冬枣多糖分别配制成1 mg/mL溶液，分别进行苯酚-硫酸反应、茚三酮反应、双缩脲反应、碘-碘化钾反应、斐林试剂反应、三氯化铁反应。

1.3.6.2 比旋度测定

将2 种冬枣多糖分别配制成10 mg/mL溶液，20 ℃条件下用1 dm的旋光管测定其旋光度。

1.3.6.3 糖醛酸含量测定

将冬枣多糖DPB配制成1 mg/mL溶液，以半乳糖醛酸为对照，采用硫酸-咔唑法［17］，在523 nm波长处测定吸光度，绘制标准曲线并计算多糖DPB中糖醛酸的含量。

1.3.7 单糖组成分析

参照文献［15］的方法，分别称取10 mg多糖样品DPA、DPB和标准单糖（鼠李糖、L-阿拉伯糖、D-甘露糖、葡萄糖、D-半乳糖）各加入3 mL 2 mol/L的三氟乙酸，封管后110 ℃条件下水解4 h，待水解产物冷却至室温，加入3 mL甲醇，50 ℃氮吹浓缩至干，重复3 次，尽量除尽三氟乙酸，得多糖水解产物。水解产物中分别加入10 mg盐酸羟胺、5 mg肌醇、0.5 mL无水吡啶，混匀后，90 ℃水浴加热30 min，取出，冷却至室温，加入0.5 mL无水乙酐，90 ℃水浴加热30 min，制得多糖样品糖腈乙酸化产物。产物在氮吹仪上浓缩至干，加入1.0 mL氯仿复溶，溶液经0.45 μm滤膜过滤后进气相色谱（gas chromatography，GC）仪分析。气相色谱条件为：SE-30毛细管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm），氢火焰离子化检测器（hydrogen flame ionization detector，FID）检测器；氢气、空气、氮气体积流量分别为16、150、20 mL/min；进样口温度230 ℃，检测器温度240 ℃；色谱柱采用程序升温，起始温度130 ℃，以5 ℃/min速率升至180 ℃/min，保持2 min，再以5 ℃/min速率升至220 ℃，保持10 min。

1.3.8 抗氧化活性研究

1.3.8.1 羟自由基（·OH）清除率的测定

将纯化后DPA和DPB分别配制成0.2、0.4、0.8、1.2、2.4、3.2、4、4.8、6.4、8.0 mg/mL的溶液，按照文献［18］，采用邻二氮菲法进行·OH清除率的测定，以VC为对照。

1.3.8.2 DPPH自由基清除率的测定

采用DPPH体系［19］测定纯化后DPA和DPB质量浓度分别为0.005、0.01、0.02、0.04、0.05、0.1、0.2、0.4 mg/mL时的DPPH自由基清除率，并以VC为对照。

2 结果与分析

2.1 冬枣多糖的提取和脱蛋白

冬枣多糖经水提醇沉，无水乙醇和丙酮洗涤，真空干燥后得冬枣粗多糖；再将粗多糖用木瓜蛋白酶-三氯乙酸法脱蛋白，得脱蛋白冬枣多糖。

2.2 冬枣多糖的脱色

以多糖脱色率和多糖保留率为指标，比较几种脱色工艺，结果见表1，活性炭脱色效果最好，其多糖脱色率为78.71%，多糖保留率为90.22%。之后将脱蛋白多糖用活性炭脱色后经减压浓缩、真空干燥得冬枣多糖DPI。

表 1 冬枣多糖不同脱色方法的结果Table 1 Pigment removal and polysaccharide retention with differentsorbents指标 活性炭 树脂LS-850 树脂AB-8 树脂D-101多糖脱色率/% 78.71 20.77 14.75 46.08多糖保留率/% 90.22 80.05 90.12 83.00

2.3 冬枣多糖的分离和纯化

DPI经洗脱，并用苯酚-硫酸法隔管检测后，由图1可知，用蒸馏水和0.2 mol/L NaCl洗脱时，各出现1 个洗脱峰，再经减压浓缩、透析后分别上Sephadex G-100凝胶色谱柱，由图2可知，用蒸馏水洗脱，均为单一洗脱峰。收集洗脱峰，经减压浓缩和真空干燥后获得2 种冬枣多糖DPA和DPB，其总糖含量分别为92.47%、84.99%，其得率分别为脱蛋白脱色多糖的11.49%、10.41%。

2.4 冬枣多糖组分的纯度及分子质量

由标准葡聚糖的洗脱体积（Ve）和蓝色葡聚糖2000外水体积（V0）及其分子质量，得标准曲线方程为Ve/V0=－0.597 8 lgMw+6.901 2（R2=0.997 3），DPA和DPB的分子质量分别为1.04×104、3.02×105D。由图2可知，DPA和DPB峰形尖锐，对称性好，说明其纯度较高，分子质量分布较为均一。

2.5 光谱分析

2.5.1 紫外光谱分析

由图3可知，将DPA和DPB分别在200～700 nm波长范围内扫描后，发现在波长200 nm附近有一个较强的吸收峰，而在260、280 nm波长处均无吸收，表明其不含核酸和蛋白质［20］。

2.5.2 红外光谱分析

由图4可知，DPA和DPB的红外光谱在3 400 cm－1附近均有1 个强的吸收峰，是多糖分子间或分子内的O—H的伸缩振动引起的；在1 638.03、1 637.41 cm－1处有强的吸收峰，为C=O不对称伸缩振动峰；在1 410 cm－1附近的峰是糖类C—H变角振动吸收峰；在1 150～1 050 cm－1的峰是吡喃型糖苷环骨架C—O变角振动吸收峰，说明分子中存在C—O—H和糖环C—O—C结构［21］；2 种多糖中分别在864.63、868.59 cm－1处有吸收峰，说明其可能含有β-D-葡萄吡喃糖吸收峰［16］，其他结构有待进一步研究确证。

2.6 理化性质分析

2.6.1 显色反应

DPA和DPB进行苯酚-硫酸反应为阳性，茚三酮反应为阴性，双缩脲反应为阴性，碘-碘化钾反应为阴性，三氯化铁反应为阴性，DPA、DPB斐林试剂反应分别为阳性和阴性，说明2 种多糖都为糖类化合物，不含氨基酸、蛋白质、淀粉，无酚羟基，其中DPA为还原多糖。

2.6.2 比旋度

DPA和DPB在20 ℃条件下测得的比旋度分别为+20.55˚、+68.01˚。

2.6.3 糖醛酸含量

一系列糖醛酸含量按照硫酸-咔唑法所绘制的标准曲线为A523 nm=0.005 8ρ+0.03，式中A523 nm为吸光度，ρ为糖醛酸质量浓度。说明在糖醛酸10.7～107 μg/mL质量浓度范围内，线性关系保持良好（R2=0.993），DPB中糖醛酸的含量分别为5.56%。

2.7 单糖组成分析

将5 种标准单糖、混合标准品及待测的2 种冬枣多糖样品分别进GC，根据保留时间确定单糖组成，根据峰面积确定单糖组成物质的量比。由图5可知，DPA的单糖组成为阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖，其物质的量比为6.66∶1.00∶6.75∶2.09；DPB的单糖组成为鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖，其物质的量比为4.33∶10.90∶1.00∶3.25∶4.78。DPA的组成主要为阿拉伯糖和葡萄糖，DPB主要组成为阿拉伯糖、半乳糖和鼠李糖。

2.8 抗氧化活性

2.8.1 ·OH清除能力

由图6可知，在一定质量浓度范围内，随着多糖质量浓度的增加，·OH清除率逐渐增加，DPA、DPB 的·OH清除率均低于VC。DPA质量浓度从0.2 mg/mL上升至8 mg/mL，其·OH清除率幅度变化较小，在8 mg/mL时，其·OH清除率为28.52%；DPB质量浓度从3.2 mg/mL上升至8 mg/mL，其·OH清除率幅度增加较大，在8 mg/mL时，其·OH清除率为78.79%。

2.8.2 DPPH自由基清除能力

由图7可知，随着DPA、DPB质量浓度的增加，DPPH自由基清除率逐渐增加，当质量浓度为0.4 mg/mL时，VC、DPA、DPB的DPPH自由基清除率分别为96.21%、9.97%、24.54%，在质量浓度在0.005～0.4 mg/mL间，DPA和DPB的DPPH自由基清除率增加缓慢，其DPPH自由基清除率均不高。

3 结 论

本实验以冬枣为原材料，经过水提醇沉干燥得冬枣粗多糖，再经木瓜蛋白酶-三氯乙酸法脱蛋白，以多糖脱色率和多糖保留率为指标，比较了活性炭和3 种树脂脱色效果，结果表明活性炭脱色效果最好，其脱色工艺条件为向脱蛋白多糖液中加入1%活性炭在40 ℃、125 r/min条件下室温振荡40 min，其多糖脱色率为78.71%，多糖保留率为90.22%。

将脱蛋白脱色多糖液经干燥，配成一定溶液上DEAE-52纤维素柱和Sephadex G-100纯化得到2 个组分DPA和DPB，采用凝胶色谱法分别对DPA和DPB进行了纯度鉴定和分子质量测定，结果表明峰形尖锐，对称性好，纯度高，其分子质量分别为1.04×104、3.02×105D。

光谱分析表明DPA和DPB不含核酸和蛋白质，具有多糖特征吸收，理化实验表明2 种多糖不含氨基酸和蛋白质，不含淀粉，无酚羟基，其中DPA为还原糖。DPA和DPB的比旋度分别为+20.55 ˚、+68.01 ˚；DPB中糖醛酸含量为5.56%。

采用糖腈乙酸酯化衍生法对DPA、DPB进行单糖组成分析，结果表明DPA的单糖组成为阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖，其物质的量比为6.66∶1.00∶6.75∶2.09；DPB的单糖组成为鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖，其物质的量比为4.33∶10.90∶1.00∶3.25∶4.78。

多糖的抗氧化活性与多糖的结构、分子质量及单糖的种类和连接方式有关［22］。对纯化的DPA和DPB进行·OH清除率和DPPH自由基清除率的测定，结果表明DPA和DPB两种多糖都具有一定的抗氧化活性，随着多糖质量浓度增加，其抗氧化活性逐渐增强，DPB具有较高的·OH清除率，而DPA和DPB的DPPH自由基清除率均不高。在一定质量浓度范围内，DPB的·OH清除率和DPPH自由基清除率均高于DPA，可能与DPB为酸性多糖含带负电荷的糖醛酸或分子质量大小有关，究其原因有待进一步研究。

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DOI:10.7506/spkx1002-6630-201613016

中图分类号：TS201.2

文献标志码：A

文章编号：1002-6630（2016）13-0089-06

收稿日期：2015-07-27

基金项目：山东省高校科研计划项目（J13LE61）

作者简介：潘莹（1982—），女，讲师，硕士，研究方向为天然产物活性。E-mail：panying111@163.com

Isolation， Purification and Antioxidant Activity of Polysaccharides from Zizyphus jujube cv.Dongzao

PAN Ying1， XU Jingwei2
（1.Department of Biological Engineering， Binzhou Vocational College， Binzhou 256603， China；2.Department of Resources and Environment， Binzhou University， Binzhou 256603， China）

Abstract:Objective: To study the monosaccharide composition， structure and antioxidant activity of polysaccharide fractions isolated and purified from Zizyphus jujube cv.Dongzao.Methods: The extraction of polysaccharides was performed by water extraction and subsequent ethanol precipitation， and after removal of proteins and pigments， the polysaccharides were purified by successive DEAE-52 cellulose column and Sephadex G-100 gel column chromatography.The purity and molecular weights of the purified polysaccharides were determined by Sephadex G-100 column chromatography.Preliminary structural characterization was carried out by ultraviolet-visible （UV-VIS） spectroscopy， infrared （IR）spectroscopy and gas chromatography （GC）.The antioxidant activity of the crude and purified polysaccharides was evaluated using the phenanthroline method and 1， 1-diphenyl-2-picrylhydroxyl （DPPH） radical scavenging activity assay.Results: Two polysaccharide fractions （DPA and DPB） were purified to homogeneity from the crude polysaccharides as identified by Sephadex G-100.The molecular weight of DPA and DPB was 1.04 × 104and 3.02 × 105D， respectively.DPA and DPB did not contain protein or nucleic acid， but contained the pyranose ring skeleton glucoside.The monosaccharide composition of DPA consisted of arabinose， mannose， glucose and galactose with a molar ratio of 6.66:1.00:6.75:2.09， whereas that of DPB consisted of rhamnose， arabinose， mannose， glucose and galactose with a molar ratio of 4.33:10.90:1.00:3.25:4.78.The crude polysaccharides， DPA and DPB all had antioxidant activity in a concentration dependent manner.The scavenging percentages of DPA and DPB at 8 mg/mL for hydroxyl radical were 28.52% and 78.79% respectively， which were 9.97% and 24.54% at 0.4 mg/mL， respectively.Conclusion: Both DPA and DPB had antioxidant activity.

Key words:Zizyphus jujube cv.Dongzao； polysaccharide； isolation and purification； structure identification； antioxidant activity