黔产茶叶中儿茶素类成分的HPLC分析研究

左爱萍,张 明,王道平,陶 晨,杨小生

(1.贵州威门药业股份有限公司，贵州 贵阳550018；2.贵州省中国科学院 天然产物化学重点实验室，贵州 贵阳 550002；3.黔南民族医学专科学校，贵州 都匀 558000)

0 引言

茶叶中多酚类物质总称茶多酚(Tea-Polyphnenols)，主要包括表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、表儿茶素(EC)、表儿茶素没食子酸酯(ECG)和表没食子儿茶素(EGC)等.其具有抗氧化、抗肿瘤、抗衰老以及降血压、调血脂、降血糖等显著生物活性[1]，是决定茶叶品质的关键因子，也是当前食品、医药领域研究的热点.儿茶素组分的含量测定常用方法有高效液相色谱法、分光光度法、近红外光谱法等[2-7]，其中高效液相色谱法因分离效果较好、定量准确而广泛应用于儿茶素类化合物的检测.

贵州是有机茶叶之乡.产地环境优越，茶叶口感醇爽、浓厚，但现有研究对儿茶素类品质成分关注不多，这不利于贵州地理标志保护产品——黔茶的系统研究.本文采用高效液相色谱法(HPLC)，以甲醇-0.1%磷酸为流动相进行梯度洗脱，考察了方法的稳定性、精密度、重复性及回收率.

1 仪器与试药

1.1 仪器

1100高效液相色谱仪,美国安捷伦公司；Welch色谱柱ultimate XB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；梅特勒-托利多AG285型电子分析天平,昆山BRANSON200型.

1.2 标准物及试剂

EC、EGC、ECG、EGCG对照品，成都瑞芬恩生物科技有限公司；甲醇，默克色谱级；EDTA、抗坏血酸，分析纯；磷酸，分析级；无水乙醇；双蒸水.

分别将500 mL无水乙醇、50 mL抗坏血酸(10.0 g/L)和50 mL EDTA(10.0 g/L)混合，添加双蒸水至1000.0 mL，摇匀制得稳定溶液，备用.

1.3 供试茶样

都匀毛尖(黔南都匀)；湄潭翠芽(特级，遵义湄潭)；兰馨(遵义湄潭)；凤冈锌硒茶(遵义凤岗)；石阡苔茶(铜仁石阡)；湄潭翠芽(优级，遵义湄潭)；贵定云雾茶(贵定)；毛峰(遵义湄潭)；大宝红茶(毕节纳雍)；贵州茗茶(遵义湄潭)等均购于贵州茶城.

2 方法

2.1 色谱条件

色谱柱C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相(A相：甲醇，B相：0.1%磷酸)梯度洗脱(见表1)，检测波长：278 nm；流速：1 mL•min-1；柱温：35℃，进样量均为5 μL.

表1 流动相梯度洗脱程序

2.2 对照品溶液的制备

分别称取EC、EGC、ECG、EGCG对照品适量置于标定的5 mL容量瓶，加稳定液溶解、定容，制成EC、EGC、ECG、EGCG质量浓度分别为56.02、75.11、371.25、392.75 mg/L的混合对照品溶液.混标色谱图如图1所示.

2.3 样品溶液的制备

精密称取干燥磨成细粉的茶叶约0.25 g，置于锥形瓶中，加入25 mL 稳定液，称重，水浴加热回流提取1 h，冷却，补重.过滤后，吸取5 mL滤液稀释至10 mL容量瓶中，稳定液定容，过0.45 μm微孔滤膜，进样分析.样品的HPLC色谱图见图2.

图1 4种儿茶素混合对照品的HPLC色谱图

图2 样品的HPLC色谱图

2.4 方法学考察

2.4.1 线性关系

精密吸取一定量的儿茶素混合对照品溶液，用稳定液梯度稀释成标准系列溶液.取5 μL注入液相色谱仪中，测定其峰面积，以峰面积值(y)为纵坐标，进样量(x)为横坐标作图，得到一条不经过原点的直线，4个指标的回归方程见表2，结果表明，儿茶素进样量在设定范围内与峰面积呈良好的线性关系.

表2 4种儿茶素线性回归方程

2.4.2 精密度考察

取标准品溶液作供试样品，连续进样5次，每次5 μL，4种儿茶素峰面积的RSD值(n=5)分别为1.01%、0.32%、2.03%、0.45%.

2.4.3 稳定性试验

取贵州黔南都匀毛尖作供样品，按前述样品处理方法制备供试液，分别在0、2、4、8、12、24h测定4种儿茶素峰面积，RSD值分别为0.89%、0.46%、1.66%、0.43%.

2.4.4 重复性试验

取贵州黔南都匀毛尖细粉6份，按2.3节方法制备供试液，测定4种儿茶素含量，RSD值分别为2.57%、2.02%、2.81%、2.32%.

2.4.5 加标回收率试验

根据重复性试验的结果，得知贵州黔南都匀毛尖四种成分中EC和EGC含量较低，ECG)和EGCG含量较高，因此回收率试验分两组进行.每组各6份，按样品处理方法制成供试溶液，EC、EGC回收率平均值为98.42%、98.74%，RSD值(n=6)分别为3.66%、3.14%.ECG、EGCG回收率平均值为99.53%、101.98%，RSD值(n=6)分别为3.93%、2.01%.

3 结果

按2.3方法，制备10种黔产名优茶叶的供试液(平行2份)，精密吸取5 μL注入液相色谱仪，以外标法计算样品中儿茶素的含量，结果见表3.

表3 10种茶叶中4种儿茶素含量

4 结论

茶多酚的含量是评价茶叶的重要指标性成分，由于茶多酚不稳定，极易氧化，所以试验中添加了EDTA和抗坏血酸作抗氧化剂，试验通过不同提取方法(超声、回流及索氏提取)和不同提取时间(0.5、1.0、1.5 h)对提取效果的影响，结果显示采用水浴提取1 h即可得到最高提取率.主要考察指标具有良好的分离度和线性关系，本法简单快速准确、灵敏度高、重现性好，成功地应用于都匀毛尖等10种茶叶中4种儿茶素含量的测定，为进一步研究其制作工艺和冲泡方法提供参考依据.由于原料、生产工艺及储存条件的不同均会引起茶叶中儿茶素含量的变化，且检测的样品均来自于市场，批次少.因此,论文中的检测结果仅是体现对本试验方法的论证和探讨，茶叶等级评定还需结合香气、滋味、氨基酸、咖啡因、微量元素等指标进行综合评价.