Allicin对DSS诱导的小鼠结肠炎的治疗作用及可能机制

陈　晶　李巧霞　李　玮　李　宏　汤　菲　王缚鲲

(中国人民解放军白求恩国际和平医院检验实验科,石家庄050082)



Allicin对DSS诱导的小鼠结肠炎的治疗作用及可能机制

陈晶李巧霞①李玮李宏①汤菲王缚鲲

(中国人民解放军白求恩国际和平医院检验实验科,石家庄050082)

[摘要]目的：明确Allicin对DSS诱导的小鼠结肠炎的治疗作用并进一步分析可能的机制。方法：将24只8周龄雄性BALB/c小鼠随机分为3组：Control组：阴性对照；DSS组：2.5%DSS诱导结肠炎；Allicin组：2.5%DSS诱导结肠炎+Allicin治疗[10 mg/(kg·d),共7 d]。结果：与DSS组比较，Allicin组疾病活动度评分及肠道炎症评分显著降低(P<0.05)。Allicin治疗组小鼠肠上皮细胞凋亡数目显著低于DSS组。Allicin治疗组小鼠肠黏膜炎症因子(IL-6、IL-1β及TNF-α)水平显著低于DSS组，差异均具有统计学意义(P<0.05)。与DSS组比较，Allicin治疗显著抑制了肠黏膜p-JAK2及p-STAT3的表达(P<0.05)。结论：Allicin对DSS小鼠肠炎具有治疗作用，可能的机制包括抗炎，保护肠上皮细胞及抑制JAK2/STAT3信号通路等。

[关键词]Allicin；动物模型；溃疡性结肠炎；凋亡；炎症

溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis，UC)是一种病因不明的炎症性肠病，病变可累及全结直肠。该病病程表现为复发与缓解相交替，无法治愈，患者有终身复发倾向。目前UC的发病机制并不清楚，但认为与遗传易感、肠道菌群及黏膜免疫异常等因素有关[1]。目前的药物治疗效果并不理想，且多数药物具有较为明显的毒副作用[2]。开发新药物有利于提高该病的治疗水平。在基础研究中常采用葡聚糖硫酸钠(Dextra sulfate sodium，DSS)建立小鼠结肠炎模型。DSS小鼠结肠炎模型是国际公认的UC动物模型[3]。Allicin是一种大蒜提取物，新近的研究表明Allicin具有抗炎、抗菌及抗肿瘤等多种功能[4,5]。我们尝试采用Allicin治疗DSS小鼠结肠炎，以期为UC的治疗寻找可能的新药物。

1材料与方法

1.1分组及干预将24只雄性BALB/c小鼠[体质量(24.8±2.5)g]饲养于SPF环境下；控制室内温度在25～27℃；防止噪声及强光灯干扰；小鼠自由饮水和进食。小鼠长至8周龄[体质量(24.8±2.5)g]时随机分为Control组、DSS组及Allicin组，每组8只。每组小鼠接受如下干预：Control组：阴性对照；DSS组：采用DSS诱导结肠炎；Allicin组：DSS诱导结肠炎+Allicin(Abcam，USA)治疗[10 mg/(kg·d),灌胃给药，共7 d]。

DSS组及Allicin组建立DSS结肠炎模型的方法依据Cooper等[6]的推荐：采用2.5%DSS(MP Biochemicals,USA)溶液取代实验小鼠的饮用水，共7天。第8天脱颈处死小鼠，取结肠组织分别储存于-80℃冰箱及福尔马林固定。

1.2检测及评估指标评估小鼠疾病活动情况：实验期间观察并记录小鼠疾病活动相关指标，并评估疾病活动度指数(Disease activity index,DAI)[3]：稀便(1分)、便血(1分)、直肠脱垂(1分)、毛发竖立(1分)，严重直肠脱垂及严重腹泻情况各加1分，累计得分为小鼠DAI最终得分。

评估小鼠肠道炎症：苏木素伊红染色后光学显微镜下观察，并计算肠道炎症评分[7]：共0～4分，分数越高代表肠道炎症越重。

评估小鼠肠上皮细胞凋亡情况：参照说明书，采用商品化TUNEL试剂盒(Roche,瑞士)检测肠上皮细胞凋亡。

评估小鼠肠黏膜炎症因子水平：刮取肠黏膜组织后匀浆，采用商品化ELISA试剂盒(R&D，美国)法检测白介素10(Interleukin-10，IL-10)、白介素6(Interleukin-6，IL-6)、白介素-1β(Interleukin-1β，IL-1β)及肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor，TNF-α)。

评估小鼠肠黏膜JAK2/STAT3信号通路的改变：采用Western blot法检测p-JAK2及p-STAT3，具体操作方法参照文献[8]，简述：提取并采用Bradford法定量蛋白，置入5×loading沸水中煮10 min(1∶4比例)，使之变性，每孔加入35 μg蛋白，电泳、转膜后封闭1 h，加入JAK2、STAT3或β-actin(1∶1 000，R&D公司)一抗，摇床12 h(4℃)，滴加二抗后洗膜，显影后行灰度值分析(Image J软件)。

2结果

2.1Allicin对DSS小鼠的治疗效果三组小鼠疾病活动度评分见图1。Allicin治疗组小鼠疾病活动度评分显著低于DSS组小鼠，相比较差异具有统计学意义(P<0.05)。

三组小鼠结肠病理组织学图片及肠道炎症评分见图2。Allicin组小鼠肠道炎症评分显著低于DSS，差异具有统计学意义(P<0.05)。

2.2Allicin对DSS小鼠肠上皮细胞凋亡的影响如图3所示，Control组小鼠肠上皮细胞未见明显凋亡，DSS组小鼠上皮细胞凋亡明显。Allicin组小鼠肠上皮细胞凋亡数量显著低于DSS组小鼠，相比较差异具有统计学意义(P<0.05)。

2.3Allicin对DSS小鼠肠黏膜炎症因子水平的影响三组小鼠肠黏膜炎症因子水平见图4。三组肠黏膜IL-10水平相比较差异均无统计学意义(P>0.05)。Allicin组小鼠肠黏膜IL-6、IL-1β及TNF-α水平显著低于DSS组小鼠，差异均具有统计学意义(P<0.05)。

2.4Allicin对DSS小鼠肠黏膜JAK2/STAT3信号通路的影响图5显示，Allicin治疗组小鼠肠黏膜p-JAK2及p-STAT3水平，相比较差异均具有统计学意义(P<0.05)。

图1　小鼠疾病活动度评分比较Fig.1　Compare of disease activity index among three groupsNote: *.P<0.05.

图2　小鼠肠道炎症评分比较Fig.2　Compare of inflammatory scores among three groupsNote: *.P<0.05.

图3　小鼠肠上皮细胞凋亡情况比较Fig.3　Compare of intestinal epithelial cell apoptosis among three groupsNote: *.P<0.05.

图4　小鼠肠黏膜炎症因子水平的比较Fig.4　Compare of intestinal mucosa inflammation factors among three groupsNote: *.P<0.05.

图5　Allicin对DSS小鼠肠黏膜JAK2/STAT3信号通路的影响Fig.5　Impact of Allicin on JAK2/STAT3 signal pathway in intestinal mucosaNote: *.P<0.05.

3讨论

UC的治疗是一个世界性难题，病情反复且不可治愈，部分患者可并发恶性肿瘤[9]。随着我国UC的发病率不断升高也引起了胃肠科医生的高度重视。虽然可以通过手术切除全结肠以彻底治疗该病，但这种致残性手术会显著影响患者的生活质量。且多数患者疾病症状并不重，可通过药物延缓疾病进展。但目前临床多采用免疫抑制剂治疗UC，其副作用较大，患者往往难以接受。Allicin是一种百合科植物提取物，属于三硫代烯丙醚类化合物[10]。目前的研究表明Allicin的药用价值极高，可能在自身免疫性疾病、肿瘤、炎症、感染性疾病等的治疗中具有应用价值[11,12]。

我们的研究显示，经过2周Allicin治疗后，Allicin组小鼠疾病活动度评分显著降低，病理学证实小鼠肠道炎症显著改善。这提示Allicin对DSS小鼠具有确定的治疗作用。肠上皮细胞凋亡是肠屏障破坏的重要表现形式，而肠屏障功能受损是UC的主要发病机制之一[13,14]。因而我们采用TUNEL法检测了小鼠肠上皮细胞凋亡情况，结果发现Allicin可显著改善由DSS引发的肠上皮细胞凋亡。这可能与Allicin的抗炎作用有关，因而我们检测了小鼠肠黏膜炎症因子的表达，结果发现Allicin显著降低了包括IL-6、IL-1β及TNF-α的水平。这提示Allicin在体可发挥抗炎功能。JAK2/STAT3信号通路参与炎症级联放大过程，且可被IL-6激活[15]。因而，我们分析并发现Allicin可抑制JAK2/STAT3信号通路。这可能是Allicin发挥抗炎作用的另一机制，但仍需进一步研究以明确。

综上所述，我们的研究证实Allicin对DSS小鼠肠炎具有治疗作用，可能的机制包括抗炎、抑制上皮凋亡及抑制JAK2/STAT3信号通路等。

参考文献：

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[6]Cooper HS,Murthy SN,Shah RS,etal.Clinicopathologic study of dextran sulfate sodium experimental murine colitis[J].Lab Invest,1993,69(2):238-249.

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[13]Du J,Chen Y,Shi Y,etal.1,25-Dihydroxyvitamin D Protects intestinal epithelial barrier by regulating the myosin light chain kinase signaling pathway[J].Inflamm Bowel Dis,2015,21(11):2495-506.

[14]Kamekura R,Nava P,Feng M,etal.Inflammation-induced desmoglein-2 ectodomain shedding compromises the mucosal barrier[J].Mol Biol Cell,2015,26(18):3165-3177.

[15]Li L,Li H,Li M.Curcumin protects against cerebral ischemia-reperfusion injury by activating JAK2/STAT3 signaling pathway in rats[J].Int J Clin Exp Med,2015,8(9):14985-14991.

[收稿2016-01-06修回2016-03-07]

(编辑倪鹏)

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.07.024

作者简介：陈晶(1970年-)，女，硕士，副主任技师，主要从事临床检验诊断学及生物技术方面研究。

通讯作者及指导教师：王缚鲲(1970年-)，男，主任医师，主要从事感染免疫方面研究。

中图分类号R574.6

文献标志码A

文章编号1000-484X(2016)07-1039-04

Therapeutical effect of Allicin for colitis mice induced by DSS and its possible mechanisms

CHEN Jing,LI Qiao-Xia,LI Wei,LI Hong,TANG Fei,WANG Fu-Kun.Department of Clinical Laboratory,Bethune International Peace Hospital of PLA,Shijiazhuang 050082,China

[Abstract]Objective:To analyze the therapeutical effect of Allicin for colitis mice induced by DSS and its possible mechanisms.Methods: A total of 24 male mice were randomly divided into Control group,DSS group(2.5% DSS,7 days) and Allicin group [DSS treatment and Allicin，10 mg/(kg·d),7 d].Disease activity index,inflammatory score,TUNEL and Western bolt were performed to analyze the effect of Allicin on colitis induced by DSS.Results: With DSS group,the Allicin group had lower disease activity score and inflammatory score(P<0.05).Allicin group had a lower number of intestinal epithelial cell apoptosis than that of DSS group,the difference was statistically significant(P<0.05).Western bolt analysis shown that Allicin treatment significantly depressed the expression of p-JAK2 and p-STAT3 in intestinal mucosa when compared with these of DSS group(P<0.05).Conclusion: Conclusion Allicin has significantly therapeutic effect on mice colitis induced by DSS,the possible mechanisms including anti-inflammatory effects,protected of the intestinal epithelial cells and inhibition of the JAK2/STAT3 signaling pathways.

[Key words]Allicin；Animal model；Ulcerative colitis；Apoptosis；Inflammation

①河北医科大学第四医院，石家庄050011。