牛血红蛋白催化香豆素体系荧光光度法测定过氧化氢

单雅琦,陈永宁,张容珲,唐宁莉

(桂林理工大学 化学与生物工程学院，广西 桂林　541004)



牛血红蛋白催化香豆素体系荧光光度法测定过氧化氢

单雅琦,陈永宁,张容珲,唐宁莉

(桂林理工大学 化学与生物工程学院，广西 桂林541004)

摘要：在pH 3.5的NaOH-H2SO4缓冲溶液中,牛血红蛋白催化H2O2氧化香豆素生成7-羟基香豆素,导致体系的荧光强度明显增强。该氧化产物在456 nm处有最大荧光强度。实验表明:在456 nm处,体系的荧光增加值ΔF与H2O2的浓度在3.940×10-7～7.880×10-5mol/L范围内呈良好的线性关系,相关系数r为0.998 5,检出限为1.25×10-8mol/L。据此建立了一种简单、灵敏度高的检测水样中痕量H2O2的荧光新方法。该方法已用于雨水及消毒液中H2O2的测定,结果满意。

关键词：过氧化氢;牛血红蛋白;香豆素;荧光法

过氧化氢普遍存在于自然生态体系中,是生物和环境系统中存在的一种重要中间产物,在食品科学、医学、化学、生物、环境保护等众多领域应用广泛。它是大气中氢过氧自由基(HOO·)浓度的指标, 还可与还原剂(如Fe2+)反应导致羟基自由基(HO·)的形成,HO·是大气和地表水中最重要的氧化剂成分之一。许多研究表明,过氧化氢可以氧化二氧化硫，从而导致大气中硫酸的形成。因此,对过氧化氢的检测具有重要意义。

到目前为止, 已经有很多方法用于检测过氧化氢,例如分光光度法[1]、 荧光光度法[2-3]、 色谱法[4-5]、 化学发光法[6-7]、 电化学法[8-9]、 原子吸收光谱法[10]、 共振散射光谱法[11-12]、 滴定法[13]等。 其中荧光分析法是一种具有高灵敏度、 高选择性的方法, 并且酶催化体系测定过氧化氢具有灵敏度高、 检出限低等优点。 由于血红蛋白具有铁卟啉辅基(天然过氧化物酶(HRP)的活性中心), 并且有三维空间结构特点, 因此具有催化活性， 可用于酶催化反应体系中。 笔者以牛血红蛋白(Hb)为过氧化物模拟酶,催化H2O2氧化香豆素生成7-羟基

香豆素,该氧化产物在456 nm处产生强荧光,据此建立了一种测定痕量H2O2的新方法。

1实验部分

1.1主要仪器

Cary Eclipse荧光光度计(美国 VARIAN);PHS-3C精密pH计(上海雷磁仪器厂);501型超级恒温器(上海市实验仪器厂)。

1.2主要试剂

牛血红蛋白工作液(Hb, 国药集团化学试剂有限公司),准确称取0.064 5 g摩尔质量为64 500 g/mol的牛血红蛋白,用水溶解配成浓度为1.0×10-5mol/L的Hb工作液,于4 ℃冰箱储存。H2O2(汕头市西陇化工厂有限公司)储备溶液, 取2 mL 30% H2O2稀释至500 mL,用高锰酸钾法标定得准确浓度为3.94×10-2mol/L,于4 ℃冰箱储存。H2O2工作溶液,7.88×10-4mol/L,临用前由储备液稀释得到。香豆素(国药集团化学试剂有限公司)溶液,4.0×10-4mol/L。NaOH-H2SO4缓冲溶液, pH 3.0～5.0,由0.2 mol/L NaOH与0.2mol/L H2SO4溶液按一定比例混合配成。HAc-NaAc缓冲溶液,pH 3.0～5.0, 由0.2 mol/L HAc与0.2 mol/L NaAc溶液按一定比例混合配成。Britton-Robinson(B-R)缓冲溶液,pH 3.0～5.0,0.04 mol/L的HAc、H3BO3、H3PO4溶液等体积混合,然后用0.2 mol/L的NaOH溶液按一定比例混合配成。

实验中所用到的试剂均为分析纯,水均为二次去离子水。

1.3实验方法

在10 mL具塞比色管中,分别加入3.0 mL NaOH-H2SO4缓冲液(pH 3.5)、1.8 mL香豆素溶液、1.0 mL Hb溶液和一定量的H2O2工作液,用二次水定容至10 mL,摇匀,于50 ℃水浴中反应60 min后, 以不加H2O2的溶液为试剂空白, 用1 cm石英比色皿,在荧光光度计上于激发波长330 nm、发射波长456 nm处测定加有过氧化氢溶液的荧光强度F和试剂空白的荧光强度F0,并计算荧光差值ΔF=F-F0。

2结果与讨论

2.1体系的荧光光谱

图1为不同体系的荧光光谱:由曲线c可知香豆素本身的荧光强度很弱;由曲线a可知Hb本身没有荧光;由曲线c和d可知,当无Hb存在时, H2O2可以氧化香豆素, 但反应进行很慢; 由曲线b和c可知, 体系在456 nm处的荧光强度基本不变, 所以香豆素与Hb基本不反应; 由曲线e可知, Hb对H2O2氧化香豆素的反应具有催化作用, 香豆素-H2O2-Hb体系的荧光强度明显增强, 最大发射波长为456 nm, 最大激发波长为330 nm。

图1　体系的荧光光谱Fig.1　Fluorescence spectra of the system 发射光谱:a—Hb; b—香豆素+Hb; c—香豆素; d—香豆素+H2O2; e—香豆素+H2O2+Hb;激发光谱:f—香豆素+H2O2; g—香豆素+H2O2+Hb

2.2实验条件优化

2.2.1缓冲溶液的选择比较了不同pH值的NaOH-H2SO4、HAc-NaAc和B-R 3种缓冲液对体系ΔF值的影响。由实验结果可知,在pH 3.5的NaOH-H2SO4缓冲液中,ΔF值最大,反应的灵敏度最高。所以选择pH 3.5的NaOH-H2SO4缓冲液为反应介质。对NaOH-H2SO4缓冲液的用量进行了考察,结果表明:当缓冲液用量为0～2.5 mL时,体系的ΔF值随缓冲液用量的增加而逐渐增大;当用量大于2.5 mL时,体系的ΔF值达到最大并基本趋于稳定,故实验选择加入pH 3.5的NaOH-H2SO4缓冲溶液3.0 mL。

2.2.2温度的选择由温度对反应ΔF值的影响可知, 在12～45 ℃,体系的ΔF值随温度的升高而增大, 当温度大于45 ℃后(45～60 ℃), ΔF值达到最大并稳定。因为Hb是一种蛋白质,所以温度过高易使Hb失活,也易使H2O2分解,因此选择在50 ℃进行反应。

2.2.3酶催化时间的选择研究了酶催化时间对反应体系ΔF值的影响:在10～50 min,体系的ΔF值随时间的增加而增大,当反应时间为50 min时,ΔF值达到最大,继续延长反应时间ΔF值保持稳定,所以选择反应进行60 min时进行测定。

2.2.4香豆素用量实验表明:当香豆素的用量在0.5～1.8 mL之间时,ΔF值随香豆素用量的增加而增大;用量大于1.8 mL后,体系的ΔF值随着香豆素用量的增加而减小,所以选择ΔF值最大时所对应的香豆素用量1.8 mL。

2.2.5Hb用量Hb在反应中作催化剂,其用量对体系ΔF值的影响较明显。当Hb用量为1.0 mL时,催化效果最明显,ΔF值达到最大值,所以在反应中加入Hb 1.0 mL。

2.3共存物质的影响

当H2O2浓度为3.94×10-5mol/L、相对误差≤± 5%时,干扰物质的允许倍数为:Mg2+(2 000);SO42-(1 000); Zn2+(500); K+(200); Al3+(100); Ca2+、 Na+、 Sr2+、 Co2+、 Pb2+、 NH4+、 NO3-、 葡萄糖、 SO32-、 尿素(20); Mn2+(10); Vc、 Ni2+(5); CO32-(2); Cu2+、NO2-、 EDTA(1); C2O42-(0.5); Fe3+(0.05)。

2.4工作曲线及检出限

在上述选定的实验条件下,绘制不同浓度H2O2与对应ΔF值的标准曲线。由所得标准曲线可知,H2O2浓度在3.940×10-7～7.880×10-5mol/L范围内与体系的ΔF值存在良好的线性关系。线性回归方程为:ΔF=6.094×106c+2.780(c为H2O2的浓度, 单位为mol/L),相关系数r=0.998 5。平行测定13次试剂空白的标准偏差S为0.025 3,由此计算得到检出限为1.25×10-8mol/L(DL=3S/K)。与已经报道的以牛血红蛋白为催化剂的相关文献[14-16]相比,本方法检出限低、灵敏度高(表1)。

2.5样品测定

在桂林市雁山区采集新鲜雨水,然后对雨水样品进行预处理。首先将雨水静置10 min,然后用滤纸过滤,取滤液进行样品测定。取雨水样品1.0 mL按实验方法进行测定,同时做加标回收实验(取雨水1.0 mL, 加H2O2标准工作液0.5 mL),结果如表2所示。

表1　测定H2O2的方法比较Table 1　Comparison of some assays for H2O2 determination　μmol/L

另取标示量为3%的医用双氧水消毒液(广东南国药业有限公司)1 mL,逐级稀释10 000倍作为待测液。取0.5 mL 待测液按实验方法进行测定并做加标回收(表2)。

表2　样品分析结果及回收率(n=5)Table 2　Analytical results of samples and recovery(n=5)

3结论

以牛血红蛋白为模拟酶，催化H2O2氧化香豆素生成荧光产物7-羟基香豆素，体系的荧光强度增强，据此建立了一种灵敏的测定痕量H2O2的新方法。方法的检出限为1.25×10-8mol/L，测定H2O2的线性范围是3.940×10-7～7.880×10-5mol/L。该方法可用于雨水及消毒液中H2O2含量的测定。

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文章编号:1674-9057(2016)02-0333-04

doi:10.3969/j.issn.1674-9057.2016.02.023

收稿日期：2015-03-24

基金项目：国家自然科学基金项目( 21165008)

作者简介：单雅琦(1989— )，女，硕士，分析化学专业。

通讯作者：唐宁莉，教授，ysshiyanshi@163.com。

中图分类号：O657.3

文献标志码：A

Fluorometric determination of hydrogen peroxide by bovine hemoglobin catalytic coumarin system

SHAN Ya-qi, CHEN Yong-ning, ZHANG Rong-hui, TANG Ning-li

(College of Chemistry and Bioengineering,Guilin University of Technology,Guilin 541004,China)

Abstract:In pH 3.5 NaOH-H2SO4 buffer solution, with bovine hemoglobin as catalyst, coumarin was oxidized to produce 7-hydroxycoumarin by hydrogen peroxide, which had strong fluorescence in acid solution. At the length of maximum emission 456 nm, the increased value of fluorescence intensity(ΔF)was linear to the concentration of hydrogen peroxide in the range of 3.940×10-7- 7.880×10-5mol/L, with a correlation coefficient of 0.998 5 and a detection limit of 1.25×10-8mol/L. Based on this, a simple and highly sensitive fluorometric method was proposed for the determination of trace H2O2. This new fluorometric method can be applied to the analysis of H2O2 in rainwater and disinfectant fluid samples with satisfactory results.

Key words:hydrogen peroxide;bovine hemoglobin;coumarin;fluorometry

引文格式：单雅琦,陈永宁,张容珲,等.牛血红蛋白催化香豆素体系荧光光度法测定过氧化氢[J].桂林理工大学学报，2016,36(2):333-336.