划痕损伤对大鼠大脑皮层微血管内皮细胞N F-κB表达及继发性死亡的影响*

黄梓雄，陈兵，聂丽容，林亨，莫伟，尹延庆，梁远生

（广东医学院附属医院，广东 湛江 524001）

划痕损伤对大鼠大脑皮层微血管内皮细胞N F-κB表达及继发性死亡的影响*

黄梓雄，陈兵，聂丽容，林亨，莫伟，尹延庆，梁远生

（广东医学院附属医院，广东 湛江 524001）

目的通过体外培养SD大鼠大脑皮层微血管内皮细胞并制作划痕损伤模型，观察划痕损伤对脑微血管内皮细胞N F-κB表达及其自噬、凋亡和坏死的影响。方法体外培养SD大鼠大脑皮层微血管内皮细胞并制作划痕损伤模型，应用N F-κB抑制剂吡咯醛二硫氨基甲酸（PD TC）干预划痕损伤脑微血管内皮细胞。随机分为对照组、单纯损伤组、损伤+抑制组，在不同时间点（损伤后1、6、12、24及48 h）分别应用免疫荧光细胞化学法测定磷酸化N F-κB p65蛋白的表达，Annexi n V/PI染色法检测凋亡、坏死，W es t ern bl ot检测自噬蛋白LC 3Ⅱ表达情况。对照组为无划痕损伤的脑微血管内皮细胞。结果脑微血管内皮细胞划痕损伤后N F-κB蛋白表达于伤后1 h开始表达增强，于24 h达高峰，与对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。凋亡、坏死及自噬各指标均随时间推移有不同程度升高，与对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。而经PD TC处理后上述变化均受不同程度的抑制，与单纯损伤组相比差异有统计学意义（P＜0.05）。结论划痕损伤后可激活脑微血管内皮细胞N F-κB表达，同时可引起脑微血管内皮细胞的自噬、凋亡和坏死。

划痕损伤；脑微血管内皮细胞；N F-κB；吡咯醛二硫氨基甲酸

大脑内有极丰富的毛细血管网，整个人脑的微血管内皮表面积约20 m2。脑微血管内皮细胞（brai n m i crovascul ar endot hel i al cel l s，BM EC）是血脑屏障的最主要成分，具有特有的形态结构及功能特征。不仅在基因、蛋白质组水平上与其他内皮细胞有明显差异［1］，而且具有细胞间紧密连接、高跨内皮阻抗、缺乏窗孔结构、极少的胞饮小泡以及选择性双向跨细胞膜转运系统等独有的特征［2］，使血脑屏障成为一个限制大多数极性分子和蛋白质运动的选择性低渗透性屏障［3］。以往忽视了BM EC在中枢神经系统中的重要作用，随着“血管神经单元（neurovascul ar uni t）”概念的提出并对脑血管疾病的深入研究，逐渐认识到神经元、胶质细胞与BM EC的伙伴关系，BM EC可以胶质细胞为桥梁与神经元进行信息交流发挥重要作用。但目前对BM EC机械性损伤的研究较少，BM EC在脑损伤后多条信号传导通路被激活，而NF-κB所参与的信号传导通路的作用还有待进一步探讨。本实验通过制作大鼠BM EC的体外划痕损伤模型，从而消除在体时炎症、缺血、感染等多种因素的干扰，研究划痕损伤对BM EC内NF-κB表达以及自噬、凋亡、坏死的影响，探讨脑损伤后BM EC继发性死亡的机制，为治疗脑损伤寻求新的治疗策略。

1　材料与方法

1.1实验材料

1.1.1实验动物SPF级健康新生SD大鼠80只，鼠龄24 h，不限雌雄，重量5～8 g，购自广东医学院动物实验中心，分批实验。

1.1.2主要试剂胎牛血清（FBS）、DM EM培养液、0.25%胰蛋白酶购自Gi bco公司，PDTC、NF-κB免疫荧光试剂盒、SDS购自Si gm a公司，FITC Annexi n V Apopt osi s Det ect i on ki t凋亡试剂盒购自BD公司，兔抗鼠Ⅷ因子多克隆抗体、FITC标记山羊抗兔IgG为Abcam公司产品，兔抗鼠磷酸化NF-κB p65单克隆抗体、兔抗鼠LC3B单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG为Cel l Si gnal i ng公司产 品 ，PVDF膜 （PVDF0.22μm） 为 M i l l pore Bi ot echnol ogy公司产品。

1.1.3主要仪器Therm o细胞培养箱，Lei ca倒置显微镜，Lei ca激光扫描共聚焦显微镜，BD流式细胞仪，Kodak X光自动洗片机，Seri al垂直转移电泳槽。

1.2方法

1.2.1脑微血管内皮细胞的原代培养、纯化及鉴定

参照文献［4］的方法并加以改良进行体外原代培养及纯化SD大鼠大脑皮层BM EC：取24 h内新生SD大鼠75%的酒精浸泡消毒，在无菌冷冻条件下取大脑皮质，剥离脑膜及血管血块，将脑皮质置于DM EM培养液中剪碎成1 m m3的小块，移入15 m l离心管，加入DM EM至2 m l，加0.25%胰蛋白酶（含0.02%EDTA）2 m l，37℃消化10～20 m i n，持续震摇。加入终浓度为10%的胎牛血清终止消化，1 000 r/m i n离心5 m i n，弃上清。加含胎牛血清的DM EM洗涤2次，吸管轻轻吹打，弃去经200目不锈钢网过筛的滤液，用DM EM液反复冲洗下滤网上的组织。经100目不锈钢网过筛并收集滤液，1 000 r/m i n离心5 m i n，弃上清液。加入0.1%Ⅱ型胶原酶1～2 m l（用量据组织多少而定），37℃水浴震荡消化15～25 m i n，加入含血清培养基终止消化后，吹打使混匀，1 000 r/m i n离心5 m i n，弃上清液。加完全培养基后轻轻吹打使其混匀，接种于已铺有明胶的培养皿上，静置于37℃、5%二氧化碳的培养箱内培养24 h后换培养液。之后每隔2～3 d更换培养液，约7～10 d见细胞融合铺满时即可进行纯化传代。纯化传代：选取培养至近融合状态的细胞，吸弃原培养基，予37℃预热的DM EM液清洗2遍，加入1∶1的0.25%胰蛋白酶及0.02%EDTA消化液，置培养箱中37℃消化1～2m i n。在相差显微镜下观察，见大部分细胞收缩变圆、间隙增大时，即刻加入1～2 m l完全培养基终止消化，用移液器轻轻吹打使细胞脱壁，收集细胞悬液，1 000 r/m i n离心5 m i n，弃上清。加完全培养基，混匀后按照1∶2接种于2个细胞培养皿内，孵育4 h取出，吸去未贴壁的细胞并更换完全培养基，置培养箱内继续培养至细胞重新生长至融合状态时，重复上述操作处理2～3次，便可得到纯度较高的大鼠BM EC。鉴定：将已纯化好的细胞消化传代接种于放有细胞培养专用盖玻片的12孔培养板中，至细胞生长至80%～90%汇合状态时，吸除培养液，用PBS洗涤1次，加入固定液固定5～15 m i n，吸除固定液，用洗涤液洗3次，每次3～5 m i n，滴加免疫染色封闭液至充分盖住样品，室温封闭1 h，吸去免疫染色封闭液，滴加1 m l兔抗大鼠第Ⅷ因子相关抗原抗体（抗体用一抗稀释液稀释，1∶100），用一抗稀释液代替一抗作为阴性对照，37℃孵育1 h或4℃孵育过夜。吸出一抗，洗涤液洗3次，每次5～10 m i n，加入FITC标记的羊抗兔IgG 1 m l（二抗稀释液稀释，1∶100），室温孵育1 h。吸出二抗，洗涤液洗涤2次，每次5～10 m i n；加入细胞核染色液（PI）使充分盖住样品，室温染色5 m i n左右，吸除细胞核染色液，用洗涤液洗涤3次，每次3～5 m i n；加适量抗荧光淬灭封片液并用盖玻片封片，应用激光扫描共聚焦显微镜进行观察。胞浆中第Ⅷ因子相关抗原的染色为绿色荧光，细胞核的PI染色为红色荧光。高倍镜下各取5个视野内细胞计数，脑微血管内皮细胞纯度=阳性细胞数/全部细胞数，求其平均值，检测脑微血管内皮细胞纯度。

1.2.2体外培养脑皮层微血管内皮细胞损伤模型的建立参考文献［5-6］损伤模型的方法加以改良。将经2次传代纯化满意的BM EC传代种植于6孔细胞培养板中培养，待细胞融合长满。将预先设计好的标准模板（其上划有纵、横平行线，间距均为4 m m）置于培养板底部，吸除培养液，PBS液轻柔洗涤2遍，无菌环境直视下使用20μl微量移液器，t i p头严格按模板线条用力均匀地制成纵、横划痕损伤，划痕宽度约1 m m。确保实验所用的BM EC损伤范围和程度一致。

1.2.3PD TC干预划痕损伤后BM EC的实验分组处理BM EC经传代纯化满意后，传代种植于6孔细胞培养板中，待细胞长满融合后，随机平均分成对照组、单纯损伤组、损伤+抑制组进行实验，重复3次。分组处理前先吸除培养板中的原培养液并用PBS液轻柔冲洗2遍。对照组加入含10μl PBS液、10%FBS的DM EM培养液3 m l；单纯损伤组按1.2.2方法建立划痕损伤模型，然后加入与对照组相同的培养液；损伤+抑制组同单纯损伤组建立损伤模型，然后加入含PDTC 10μl、10%FBS的DM EM培养液3m l（PDTC的终浓度为20μm ol/L）。各组分别于处理后1、6、12、24及48 h 5个时间点进行实验。

1.2.4免疫荧光细胞化学方法检测磷酸化N F-κB P65蛋白的表达弃去培养液，用冷PBS洗2遍，固定液固定30 m i n，洗涤2遍，滴加免疫染色封闭液，室温封闭1 h，吸去封闭液后滴加一抗（1∶100稀释的兔抗鼠磷酸化的NF-κB p65单克隆抗体）湿化盒中4℃孵育过夜。洗涤2遍，加二抗（1∶100稀释的FITC标记山羊抗兔IgG），37℃避光孵育1 h，洗涤2遍，激光共聚焦显微镜下观察。阴性对照组用0.01 m ol/L PBS代替一抗。以细胞核及胞浆内出现绿色荧光为阳性细胞，细胞内无绿色荧光为阴性细胞。利用Lei ca Conf ocal图像分析软件对荧光结果进行图像分析，得出各组阳性细胞不同荧光强度值，从而得出各组中不同时间点磷酸化NF-κB P65蛋白表达的程度。

1.2.5Annexi n V/PI apopt os i s ki t检测凋亡及坏死收集细胞培养液到一离心管中，用0.25%不含EDTA胰酶消化细胞至细胞可以被移液管或枪头轻轻吹打下来时，终止消化。将细胞吹打下来，细胞悬液移至上述收集细胞培养液的离心管内混匀，1 000 r/m i n离心5 m i n，弃上清液后冷PBS液洗涤细胞2次。用500μl Bi ndi ng Buf f er悬浮细胞，滴加5μl Annexi n V-FITC并轻轻混匀，于2～8℃避光条件下孵育15m i n。滴加5μl PI后轻轻混匀，于2～8℃避光条件下孵育5 m i n。1 h内用流式细胞仪检测，激发波长为488 nm，每个样本均获取10 000个细胞进行分析。

1.2.6W es t ern bl ot检测自噬标志性蛋白LC 3Ⅱ表达情况于各个时间点提取各组细胞蛋白，用BCA蛋白定量试剂盒检测蛋白浓度，分装，保存于-80℃冰箱中。等量蛋白样品经SDS-PAGE电泳分离，电转移至PVDF膜上。再用封闭液室温下摇动封闭1h，一抗（抗LC3 1∶1 000）4℃过夜，二抗（辣根过氧化物酶标记羊抗兔1∶5 000）室温1 h。以上步骤操作后均用TBST缓冲液洗膜（15 m i n×3次），ECL显色，X光片曝光，X光自动洗片机洗片显影。胶片扫描、拍照，采用Im age J软件采集结果图像，取检测蛋白与内参灰度值的比值。

1.3统计学方法

采用SPSS 17.0统计软件进行数据处理，计量资料用均数±标准差（±s）表示，不同处理组、不同时间点的组内比较用单因素方差分析，多重比较用LSD检验法或SNK检验法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1体外培养SD大鼠BM EC形态及鉴定

倒置显微镜下见分离的脑微血管段长短不等、形态各异，呈单支或多支状（见附图A）。经胶原酶消化后，微血管管壁不清，但壁上BM EC清晰可见。培养24 h后，见微血管片段大部分已贴壁，BM EC从贴壁的微血管段周围爬出，细胞多呈短梭形或多角形，排列不规则，核淡，胞膜明显。培养2～3 d，细胞分裂增殖形成散在细胞群落，呈旋涡状生长。7～9 d细胞呈长梭形、多角形，融合成片，排列紧密，互不重叠，形成致密的单层细胞，呈典型的“铺路石”征象。初种的传代细胞呈明亮的圆球形，悬浮于培养液中，4 h后大部分贴壁，细胞呈扁平状，24 h后胞体变大。随培养时间延长，BM EC多呈三角形、长梭形，约7～9 d，BM EC增殖成单层片状（见附图B）。免疫细胞荧光染色后，镜下所有的细胞核呈红色荧光，含第Ⅷ因子相关抗原的细胞浆呈绿色荧光，标记为阳性细胞（见附图C）。以随机5个不同视野中阳性细胞数占总细胞数的比例为细胞的纯度，本实验所培养的BM EC纯度约90%。将细胞培养至80%～90%汇合状态时，便可进行划痕（见附图D）和药物干预实验。

附图　脑微血管内皮细胞

2.2免疫荧光细胞化学方法检测磷酸化N F-κB p65蛋白表达

损伤后1 h各组磷酸化NF-κB p65蛋白表达量两两比较差异无统计学意义（P＞0.05）。随损伤时间延长NF-κB表达量逐渐增加，以24 h时改变最显著，单纯损伤组从6 h始差异有统计学意义（P＜0.01），48 h与24 h比较变化不明显。损伤+抑制组于加入NF-κB抑制剂PDTC后，24 h始增加，6 h始NF-κB蛋白的表达较单纯损伤组有所减少，与单纯损伤组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

2.3凋亡及坏死情况

1 h单纯损伤组与损伤+抑制组凋亡程度差异无统计学意义（P＞0.05），但与对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。随着损伤时间延长，损伤组细胞凋亡程度相应增大。自6 h始单纯损伤组与损伤+抑制组比较，两者差异有统计学意义（P＜0.05）。单纯损伤组的凋亡程度总体大于损伤+抑制组，凋亡的峰值出现在24 h（见表2）。对照组在细胞正常代谢状态下坏死不明显，与抑制组之间差异无统计学意义（P＞0.05）。损伤后细胞坏死明显，单纯损伤组及损伤+抑制组细胞坏死程度自1 h始即与对照组比较差异有统计学意义（P＜0.01），而单纯损伤组与损伤+抑制组之间差异无统计学意义（P＞0.05）。随损伤时间延长，损伤+抑制组坏死程度总体低于单纯损伤组，自6 h始两组间坏死程度差异有统计学意义（P＜0.05）。24 h坏死达高峰（见表3）。

表1　各组细胞不同时间点磷酸化N F-κB p65荧光值比较 （n=3，±s）

表1　各组细胞不同时间点磷酸化N F-κB p65荧光值比较 （n=3，±s）

注：1）与对照组比较，P＜0.05；2）与单纯损伤组比较，P＜0.05

组别4 8 h对照组　1 . 0 3 ± 0 . 0 6 　1 . 0 1 ± 0 . 0 3 　1 . 0 5 ± 0 . 0 5 　1 . 0 3 ± 0 . 0 6 　1 . 0 2 ± 0 . 0 5单纯损伤组　1 . 5 2 ± 0 . 0 41）　2 . 6 4 ± 0 . 0 61）　3 . 6 4 ± 0 . 1 61）　6 . 0 2 ± 0 . 1 21）　6 . 0 3 ± 0 . 1 01）损伤+抑制组　1 . 5 2 ± 0 . 0 21）　1 . 5 3 ± 0 . 0 31）2）　1 . 5 2 ± 0 . 0 51）2）　4 . 4 5 ± 0 . 0 21）2）　3 . 6 2 ± 0 . 0 21）2）1 h 6 h 1 2 h 2 4 h

表2　各组细胞不同时间点凋亡百分率的比较 （n=3，±s）

表2　各组细胞不同时间点凋亡百分率的比较 （n=3，±s）

注：1）与单纯损伤组比较，P＜0.05；2）与对照组比较，P＜0.05

组别4 8 h对照组　1 0 . 7 0 ± 0 . 1 71）　1 0 . 5 7 ± 0 . 7 11）　1 0 . 4 3 ± 0 . 7 01）　1 1 . 2 7 ± 1 . 1 01）　1 1 . 6 0 ± 0 . 5 31）单纯损伤组　1 2 . 3 7 ± 0 . 3 52）　1 3 . 7 0 ± 0 . 4 02）　1 4 . 5 3 ± 0 . 6 52）　1 6 . 3 0 ± 0 . 5 62）　1 6 . 2 3 ± 0 . 5 72）损伤+抑制组　1 2 . 2 3 ± 0 . 3 12）　1 2 . 7 0 ± 0 . 4 01）2）　1 2 . 8 0 ± 1 . 1 11）2）　1 3 . 8 0 ± 0 . 3 61）2）　1 3 . 8 0 ± 0 . 8 11）2）1 h 6 h 1 2 h 2 4 h

2.4自噬情况

在1 h，单纯损伤组、损伤+抑制组之间比较差异无统计学意义（P＞0.05），但与对照组比较差异有显著统计学意义（P＜0.01）。损伤后6 h始单纯损伤组与损伤+抑制组比较差异均有统计学意义（P＜0.01），24 h达高峰。见表4。

表3　各组细胞不同时间点坏死情况比较 （n=3，±s）

表3　各组细胞不同时间点坏死情况比较 （n=3，±s）

注：1）与单纯损伤组比较，P＜0.05；2）与对照组比较，P＜0.05

组别4 8 h对照组　1 . 5 0 ± 0 . 2 01）　1 . 4 7 ± 0 . 3 11）　1 . 5 3 ± 0 . 5 6 　1 . 5 6 ± 0 . 3 51）　1 . 6 0 ± 0 . 5 31）单纯损伤组　1 2 . 3 0 ± 0 . 3 02）　1 3 . 8 0 ± 0 . 4 02）　1 4 . 6 3 ± 0 . 6 52）　1 6 . 3 0 ± 0 . 4 62）　1 6 . 2 7 ± 0 . 5 12）损伤+抑制组　1 2 . 2 3 ± 0 . 3 82）　1 2 . 8 0 ± 0 . 4 01）2）　1 2 . 7 7 ± 1 . 1 21）2）　1 3 . 8 0 ± 0 . 2 61）2）　1 3 . 8 3 ± 0 . 1 51）2）1 h 6 h 1 2 h 2 4 h

表4　各组细胞不同时间点LC 3 I I表达与内参蛋白表达比值 （n=3，±s）

表4　各组细胞不同时间点LC 3 I I表达与内参蛋白表达比值 （n=3，±s）

注：1）与单纯损伤组比较，P＜0.05；2）与对照组比较，P＜0.05

组别4 8 h对照组　0 . 1 4 ± 0 . 0 21）　0 . 1 6 ± 0 . 0 11）　0 . 1 7 ± 0 . 0 1 　0 . 1 9 ± 0 . 0 11）　0 . 2 0 ± 0 . 0 11）单纯损伤组　0 . 2 4 ± 0 . 0 22）　0 . 5 5 ± 0 . 0 22）　0 . 7 7 ± 0 . 0 92）　1 . 2 1 ± 0 . 0 42）　1 . 1 8 ± 0 . 0 42）损伤+抑制组　0 . 2 5 ± 0 . 0 32）　0 . 2 5 ± 0 . 0 21）2）　0 . 2 6 ± 0 . 0 3 　0 . 4 4 ± 0 . 0 31）2）　0 . 4 4 ± 0 . 0 31）2）1 h 6 h 1 2 h 2 4 h

3　讨论

既往忽视了BM EC在中枢神经系统中的重要作用，随着“血管神经单元（neurovascul ar uni t）”概念的提出并对脑血管疾病的深入研究，逐渐认识到神经元、胶质细胞与BM EC的伙伴关系，BM EC可以胶质细胞为桥梁与神经元进行信息交流，发挥着重要作用。对创伤性脑损伤后早期BM EC的超微结构观察可见线粒体等超微结构发生一系列病理改变，甚至部分血管可见内皮断裂，内皮细胞消失［7-8］。应用中药通络救脑注射液作用于BM EC后收集到的条件培养液中神经元的生存活性明显提高［10］。所以BM EC在脑损伤后的生存和死亡将直接影响到神经细胞的生存。

NF-κB以非活化形式广泛存在于静止期细胞的胞质中，多以蛋白二聚体与其特异性抑制蛋白IκB（i nhi bi t or κB，IκB）形成三聚体。当细胞受到刺激，IκB发生磷酸化而失活，暴露出活性的p50-p65；或因p105的C-端磷酸化降解从而形成活性的p50-p65复合体。p50-p65转移到细胞核并与目标基因增强子的GGGRNNYY-CL序列结合，从而启动或调节早期反应基因的转录，参与炎症反应、细胞增殖和细胞凋亡等［10-14］。而抗氧化剂PDTC可特异性阻断NF-κB的传导通路［15］。细胞的继发性死亡形式有3种：包括自噬、凋亡和坏死。脑损伤后NF-κB信号转导通路对BM EC继发性死亡的影响逐渐成为研究热点。

实验结果表明，损伤后BM EC内的NF-κB被激活，具有活性的磷酸化NF-κB p65蛋白表达量随着损伤时间的延长而逐渐增加，损伤后12 h至24 h增加较快，于24 h达峰值，但48 h与24 h比较变化不明显。而且损伤后体外培养的 BM EC内NF-κB表达有一定的时间依赖性，与在体颅脑损伤后NF-κB的表达水平［16］基本一致。与此同时，损伤后BM EC的自噬、凋亡及坏死的相关指标也有不同程度的增加。而在损伤后加入NF-κB抑制剂PDTC后，磷酸化NF-κB p65蛋白表达量较单纯损伤组有所减少；相应地，BM EC的自噬、凋亡及坏死的相关指标也较单纯损伤组有不同程度的减少。推测划痕损伤可能通过激活NF-κB表达进而引发下游反应，从而引起BM ECs的自噬、凋亡及坏死。划痕损伤后1 h至12 h自噬和凋亡指标明显增加，而坏死于12 h后明显增加，于24 h各项指标几乎达到峰值。推测，激活NF-κB通路后，早期BM EC以凋亡和自噬这种自我保护形式为主，至晚期细胞炎症因子大量表达，或凋亡、自噬过分表达，则以坏死为主。提示合理使用NF-κB抑制药物（如PDTC）可以有效缓解脑损伤后BM EC各种死亡的程度，保持血脑屏障的完整性，稳定脑组织内环境，从而改善颅脑损伤的预后。与此同时，应用PDTC抑制NF-κB信号通路后，BM EC的凋亡、自噬及坏死进程并未被彻底阻断，可能是PDTC不能完全阻断NF-κB信号通路的活化，亦不能完全排除NF-κB通路通过其他机制参与BM EC死亡而不能被PDTC所抑制的情况。凋亡、自噬及坏死是多通路、多环节、紧密联系并互相影响的复杂体系［17-19］，关于调节BM EC凋亡、自噬和坏死的更深一步机制以及细胞信号通路之间的交叉作用需要进一步深入研究。

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（申海菊编辑）

Effects of scratching damage on NF-κB expression in brain microvascular endothelial cells and secondary death of rats*

Zi-xiong Huang，Bing Chen，Li-rong Nie，Heng Lin，Wei Mo，Yan-qing Yin，Yuan-sheng Liang
（The Affiliated Hospital of Guangdong Medical College，Zhanjiang，Guangdong 524001，China）

Objective To culture brain microvascular endothelial cells（BMECs）of SD ratsin vitroand construct a model of scratching injury，so as to observe the effect of scratching injury on NF-κB expression as well as autophagy，apoptosis and necrosis of of BMECs.Methods BMECs of SD rats were culturedin vitroand scratching injury was implemented，then the cells were treated with pyrrolidine dithiocarbamate（PDTC），an NF-κB inhibitor.The cells were randomly devided into control group，simple-injury group and injury-inhibition group.At 1，6，12，24 and 48 hours after injury，NF-κB p65 expression was measured using immunofluorescent cytochemistry assay，apoptosis and necrosis of the cells were determined by Annexin V/PI staining，and expression of autophagy-related protein LC3 II was determined by Western blot.An uninjured group of BMECs was set as control.Results After scratching injury，NF-κB expression of the BMECs was enhanced from 1 h after injury，and peaked at 24 h，significantly higher than that of the control group（P＜0.05）.Indicators for apoptosis，necrosis and autophagy all increased to different extents as time went on，and they showed significant differences from those of the control group（P＜0.05）；while PDTC treatment following injury significantly inhibited these changes（P＜0.05）.Conclusions Scratching damage activates NF-κB expression of BMECs and causes autophagy，apoptosis and necrosis of BMECs.

scratching damage；BMEC；NF-κB；PDTC

R 651.15

A

1005-8982（2016）05-0011-06

10.3969/j.i s s n.1005-8982.2016.05.003

2015-10-21
*

2012年广东医学院附属医院青年科研基金（No：Qk1308）；2013年广东医学院青年科研基金（No：XQ1315）；2014年度湛江市非资助科技攻关计划项目（No：湛科［2014］27号2014B101）

陈兵，E-m ai l：ChenBabee0@yeah.net