TLCS同时测定珠黄散中4种胆汁酸含量

陈蓉陈伟顾炳仁（苏州市食品药品检验所，江苏苏州504；苏州市中医医院，5006）

TLCS同时测定珠黄散中4种胆汁酸含量

陈蓉1陈伟2顾炳仁1（1苏州市食品药品检验所，江苏苏州215104；2苏州市中医医院，215006）

目的：建立同时测定珠黄散中胆酸、猪去氧胆酸、去氧胆酸、鹅去氧胆酸含量的方法。方法：以甲醇为提取溶剂，制备供试品溶液应用于薄层色谱扫描法，使用硅胶G高效薄层板，以异辛烷-乙酸乙酯-冰醋酸（15∶7∶6）为展开剂，10%硫酸乙醇溶液为显色剂，460 nm为测定波长，进行薄层定量扫描。结果：胆酸、猪去氧胆酸、去氧胆酸、鹅去氧胆酸分别在0.20～2.00μg（r≥0.999）内含量与峰面积积分值呈良好的线性关系，平均回收率（n=6）分别为95.88%（RSD=1.86%），97.43%（RSD=2.23%），96.24%（RSD=2.78%），96.63% （RSD=1.87%）。测得12批珠黄散中4种胆汁酸平均含量分别为31.94，6.36，20.19，10.53 mg/g。结论：该方法专属性强，重复性好，适用于珠黄散中4种胆汁酸的含量测定及质量控制。

珠黄散；胆酸；猪去氧胆酸；去氧胆酸；鹅去氧胆酸；薄层色谱扫描法；含量测定

珠黄散来源于清代综合性医书《医级》，为传统方剂［1］。由人工牛黄与珍珠配伍组成，具有清热解毒，化腐生肌的功效。主治喉痹、乳蛾、口疮、牙疳等症。用于热毒内蕴所致的咽痛、咽部红肿、糜烂、口疮溃疡久不收敛［2］。现代医学常用于急性咽炎，急性扁桃体炎，复发性口腔溃疡，牙龈炎，压疮等［3-5］。方中珍珠清热解毒，生肌敛疮，牛黄清热解毒凉血，二药配伍，共奏清热解毒，祛腐生肌之效。目前，珠黄散的国家标准为《中国药典》以及卫生部药品标准。《中国药典》标准相对完善，部颁标准内容较为简单。《中国药典》2015年版一部采用薄层色谱扫描法（TLCS）测定珠黄散中胆酸含量来控制人工牛黄的质量。人工牛黄主要成分为胆汁酸类，主要包含胆酸、猪去氧胆酸、去氧胆酸、鹅去氧胆酸。可见，单一测定胆酸含量来评价珠黄散中人工牛黄质量并不完善。本文拟建立TLCS同时测定胆酸、猪去氧胆酸、去氧胆酸、鹅去氧胆酸4种胆汁酸类成分，该方法专属性强，重复性好，适用于珠黄散中4种胆汁酸的含量测定及质量控制，能较为全面反映方中人工牛黄的质量。

1　仪器与试药

Camag TLC Scanner 3型薄层扫描仪（瑞士卡玛生化科技有限公司）；Camag Automatic TLC Sampler 4型全自动点样仪（瑞士卡玛生化科技有限公司）；XS105DU型电子天平（北京赛多利斯仪器公司）；KQ-400GKDV超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；硅胶G高效薄层色谱板（100 mm×200 mm×0.25 mm，Merck KGaA）；BUCHI B-811全自动索氏提取仪（瑞士步琪有限公司）。

2　方法与结果

2.1　对照品溶液的制备

取105℃干燥至恒重的对照品胆酸、猪去氧胆酸、去氧胆酸品、鹅去氧胆酸适量，加甲醇制成每lm L含胆酸0.200 2mg、猪去氧胆酸0.200 5mg、去氧胆酸0.200 4 mg、鹅去氧胆酸0.200 2 mg的混合对照品溶液，即得。

2.2　供试品溶液的制备

取珠黄散样品0.2 g，精密称定，置索氏提取器中，加甲醇适量，加热回流提取2 h，提取液蒸干，残渣加甲醇使溶解，转移至10 m L量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。

2.3　试验条件

精密吸取供试品溶液5μL，对照品溶液2μL 与10μL，分别交叉点于同一硅胶G薄层板上，以异辛烷-乙酸乙酯-冰醋酸（15∶7∶6）为展开剂，展距8 cm，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，取出，在薄层板上覆盖同样大小的玻璃板，周围用胶布固定；条带点样，带宽6 mm；扫描光源为钨灯，波长460 nm，狭缝宽度4.00×0.30 mm，扫描速度20 mm/s。测量供试品吸光度积分值与对照品吸光度积分值，外标二点法计算，即得。

2.4　线性关系的考察［6］

精密吸取上述混合对照品溶液各1，2，4，6，8，10μL，分别点于薄层板上，按上述“2.3”项方法测定吸光度积分值，以对照品进样质量为自变量（X），峰面积积分值为因变量（Y），绘制标准曲线，得回归方程：

胆酸：

Y=3.113 X+1 775（r=0.999 9），

猪去氧胆酸：

Y=1.482 X+894.2（r=0.999 9），

王世君身为鸡东县公路管理站工程师兼农村公路路网改造工程建设指挥部总工程师，自参加工作以来，便一直从事公路与桥梁建设、养护与管理工作。他刻苦钻研业务知识，兢兢业业、务实创新，所负责的各项工作都取得了长足的发展。

去氧胆酸：

Y=0.647 9 X+1 076（r=0.999 6），

鹅去氧胆酸：

Y=1.376 X+1 701（r=0.999 8）。

实验表明，胆酸、猪去氧胆酸、去氧胆酸、鹅去氧胆酸在0.20～2.00μg范围内具良好的线性关系。

2.5　空白试验

按处方工艺制备不含人工牛黄的阴性样品，即取珍珠对照药材，按“2.2”项下方法制备阴性对照溶液。与供试品溶液、对照品溶液点于同一薄层板上，按上述“2.3”项方法进行展开、显色、扫描。结果阴性样品在胆酸、猪去氧胆酸、鹅去氧胆酸、去氧胆酸对照品相应的色谱位置无吸收，表明其他成分对混合对照品的测定无干扰。样品色谱中，胆酸（Rf：0.31）、猪去氧胆酸（Rf：0.50）、鹅去氧胆酸（Rf：0.62）、去氧胆酸（Rf：0.67）与前后斑点之间分离清晰，无其他成分干扰。见图1，2。

1　薄层色谱平面图

2.6　精密度试验［7］

2　薄层色谱扫描图

2.6.1同板精密度试验精密吸取同一供试品溶液（120101）5μL，在同一硅胶G薄层板上分别点样6次，同上述“2.3”项进行测定，结果胆酸、猪去氧胆酸、去氧胆酸品、鹅去氧胆酸的RSD分别为1.05%，1.57%，1.20%，1.72%，表明仪器同板精密度良好。

2.6.2异板精密度试验精密吸取同一供试品溶液（120101）5μL，在6块不同硅胶G薄层板上分别点样，同上述“2.3”项进行测定，结果胆酸、猪去氧胆酸、去氧胆酸、鹅去氧胆酸的RSD分别为1.44%，1.84%，0.93%，0.86%，表明仪器异板精密度良好。

2.7　稳定性试验［8］

精密吸取同一供试品溶液（120101）5μL，点样，展开，显色至斑点清晰，按上述“2.3”项方法于0，10，20，30，40，60 m in测定其峰面积。结果，胆酸、猪去氧胆酸、去氧胆酸、鹅去氧胆酸峰面积RSD分别为0.71%，1.31%，1.39%，1.60%。结果表明供试品在60 m in内稳定性良好。

2.8　重复性试验

取同一珠黄散样品（120101）6份，精密称定，分别按“2.2”项下方法制备供试品溶液。点样5μL，展开，显色至斑点清晰，按上述“2.3”项方法测定其峰面积值。结果，胆酸、猪去氧胆酸、去氧胆酸、鹅去氧胆酸平均含量分别为33.89，6.23，18.64，10.03 mg/g，RSD分别为0.73%，1.64%，1.23%，1.00%。结果表明该测定方法重复性良好。

2.9　加样回收试验

取已知含量的珠黄散样品（120101，含胆酸34.00 mg/g，猪去氧胆酸6.10 mg/g，鹅去氧胆酸9.98 mg/g，去氧胆酸18.28 mg/g），研细，精密称定0.1 g，加入“2.1”项下混合对照品溶液5.0 m L，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，平行6份，点样5μL，展开，显色至斑点清晰，按上述“2.3”项方法测定其峰面积值。计算回收率，结果见表1。

2.10　样品测定

分别称取所收集的12批珠黄散样品适量，精密称定，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，点样5μL，展开，显色至斑点清晰，按上述“2.3”项方法测定其峰面积值，计算胆酸、猪去氧胆酸、去氧胆酸、鹅去氧胆酸含量。结果见表2。

根据上述测定结果，12批珠黄散中胆酸含量均符合《中国药典》2015年版每1 g不得少于26.0mg的规定。猪去氧胆酸、鹅去氧胆酸、去氧胆酸含量均较胆酸含量低。各批次之间含量差异不明显。从表2可知，胆酸含量约为胆汁酸总量的一半，故单一测定胆酸含量来反映人工牛黄的质量并不全面，建议同时测定这4种胆汁酸含量，以总量计，来评价人工牛黄的品质，更为合适。

表1　胆酸、猪去氧胆酸、鹅去氧胆酸、去氧胆酸加样回收率试验（n=6）

表2　珠黄散含量测定结果（n=3，?±s）（mg/g）

3　讨论

胆汁酸类成分的含量测定方法有比色法［9］、高效液相色谱法［10-12］、薄层色谱扫描法［13］、毛细管电泳法［14］等，这些方法多限于单组分测定。其中定量测定最常用高效液相色谱法，但因胆汁酸类物质是不具有荧光性质的甾体化合物，结构中无共轭双键，不含有生色团，有末端吸收，溶剂干扰大，因此需要采用蒸发光散射检测器，相比紫外检测器，测定时间更长，准确度较低。TLCS能够较为简便快速地同时测定4种胆汁酸。经过10%硫酸乙醇显色后，在日光和紫外光灯365 nm下，均能清晰分离。较为直观实用。

本测定方法基本参照《中国药典》2015年版一部珠黄散项下胆酸的含量测定方法，因其只测定人工牛黄中胆酸这一成分，并不能同时分离4种胆汁酸，故测定结果不全面。经改进，以甲醇为提取溶剂，样品中除一些无机盐、胆红素外，大多数成分能溶于甲醇，较为便捷。采用全自动索氏提取仪制备样品，异辛烷-乙酸乙酯-冰醋酸（15∶7∶6）为展开剂，得到的Rf值在0.3～0.7之间，较为适当，可将4种成分较好分离，并能做到同步含量测定，使测定结果更准确。

珠黄散作为传统方药，临床应用普遍，但现代研究较少，特别是制剂质量控制还不完善。本文建立了TLCS同时测定胆酸、猪去氧胆酸、去氧胆酸、鹅去氧胆酸4种胆汁酸类成分，该方法专属性强，重复性好，适用于珠黄散中4种胆汁酸的含量测定及质量控制，能较为全面反映方中人工牛黄的质量。可为《中国药典》中珠黄散含量测定标准的提高作一参考。

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Simultaneous Determ ination of Contents of Four Bile Acids in Zhuhuang San by TLCS

Chen Rong1，Chen Wei2，Gu Bingren1（1 Suzhou Institute for Food and Drug Control，Jiangsu Suzhou 215104，China；2 Suzhou Hospital of Traditional Chinese Medicine，215006）

Objective：To develop a method for simultaneous determination of contents of four bile acids，i.e. cholic acid，hyodeoxycholic acid，deoxycholic acid and chenodeoxycholic acid，in zhuhuang san.Methods：Test sample solution was prepared for TLCS using methanol as an extraction solvent.Silica gel prefabricate thin layer plate was used w ith isooctane-ethyl acetate-glacial acetic acid（15∶7∶6）as a developing solvent and 10%alcoholic solution of sulfuric acid as a color development reagent.TLCS was performed at a detection wave-length of 460 nm.Results：There was a good linear relation between the integrated peak area and the contents of four bile acids at a range of 0.20～2.00μg（r≥0.999）.The average recovery rates（n=6）of cholic acid，hyodeoxycholic acid，deoxycholic acid and chenodeoxycholic acid were 95.88%（RSD=1.86%），97.43%（RSD=2. 23%），96.24%（RSD=2.78%）and 96.63%（RSD=1.87%）respectively.The average contents of the above-mentioned four bile acids in 12 batches of zhuhuang san were 31.94，6.36，20.19 and 10.53 mg/g respectively.Conclusion：The method showed high specificity and reproducibility，which was suitable for the determ ination of contents of four bile acids in Zhuhuang San.

Zhuhuang San；Cholic Acid；Hyodeoxycholic Acid；Deoxycholic Acid；Chenodeoxycholic Acid；Thin Layer Chromatography Scanning（TLCS）；Consent Determ ination

10.3969/j.issn.1672-5433.2016.07.002

苏州市“科教兴卫”青年科技项目（KJXW 2015028）

陈蓉，女，硕士，主管中药师。主要从事中药品质评价工作。E-mail：kedingyu@126.com
顾炳仁，男，硕士生导师，主任药师。主要从事从事药物分析工作。通讯作者E-mail：gubinren@126.com

2016-02-24）