熊果酸对糖尿病大鼠一般表征和糖脂代谢的影响

石亚静张欢李云翠陈雪品成曦爽吕志伟齐亚娟，3韩淑英，3（华北理工大学基础医学院，河北唐山063000；华北理工大学教务处；3河北省慢性疾病重点实验室及唐山市慢性病临床基础研究重点实验室）



熊果酸对糖尿病大鼠一般表征和糖脂代谢的影响

石亚静1张欢1李云翠1陈雪品1成曦爽1吕志伟2齐亚娟1，3韩淑英1，3
（1华北理工大学基础医学院，河北唐山063000；2华北理工大学教务处；
3河北省慢性疾病重点实验室及唐山市慢性病临床基础研究重点实验室）

目的：研究熊果酸（UA）对高脂饲料和链脲佐菌素（STZ）诱导的糖尿病大鼠一般表征和糖脂代谢的影响，为熊果酸的临床应用提供实验依据。方法：大鼠4周高脂饮食后单次尾静脉注射STZ（30 mg/kg）制造糖尿病大鼠模型。设正常对照组（NCG）、糖尿病模型组（MCG）、二甲双胍组（MFG，100 mg/kg）、熊果酸高剂量组（UAHG，100 mg/kg）及熊果酸低剂量组（UALG，50 mg/kg）。每天灌胃给药一次，持续6周，动态监测大鼠体质量、进食量、饮水量、随机血糖（RBG）；实验结束后测定糖耐量（OGTT）及血清中总胆固醇（CHO）、三酰甘油（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-c）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-c）。结果：与模型组相比，UAHG可显著降低糖尿病大鼠摄食量、饮水量、RBG，抑制体质量减轻，改善OGTT，使葡萄糖曲线下面积（AUC）减小（P＜0.01 或P＜0.05）；UAHG和UALG均显著降低血清中CHO、TG（P＜0.05或P＜0.01），UALG可明显降低LDL-c（P＜0.01）。结论：熊果酸具有改善糖尿病大鼠一般表征，降低血糖，调节血脂，纠正糖脂代谢紊乱的作用。

熊果酸；糖尿病；表征；糖脂代谢；血糖；血脂

糖尿病是一种常见的，具有遗传倾向，以高血糖为主要特征的慢性代谢紊乱性疾病，血中胰岛素绝对或相对不足和靶细胞对胰岛素敏感性降低是造成糖脂代谢紊乱的两大因素［1］，糖脂代谢紊乱又可引起糖尿病并发症［2］，并发症是糖尿病患者致死致残的重要原因。故而，积极纠正糖尿病糖脂代谢异常对降低糖尿病的死亡率及改善患者生存质量是十分重要的。临床用于糖尿病的药物很多，但理想的药物并不多［3］。近年来已有文献报道熊果酸具有降低血糖和调节血脂作用［4］。为进一步验证熊果酸对糖尿病的治疗作用，本实验观察了熊果酸对糖尿病大鼠模型一般表征及糖脂代谢的影响，为熊果酸临床应用于糖尿病及其并发症的防治提供实验依据。

1　材料

1.1　动物

45只雄性SPF级（无特定病原体动物）SD大鼠，体质量230～260 g，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，许可证号：SCXK（京）2014-0004；大鼠饲料购于北京科澳协力饲料有限公司，合格证号：SCXK（京）2014-0010；高脂饲料由北京华阜康生物科技股份有限公司提供，合格证号：SCXK（京）2014-0008。

1.2　药品与试剂

链脲佐菌素（streptozocin，STZ）购于Sigma-Aldrich Co.LLC（西格玛奥德里奇）公司（CAS登记号：18883-66-4）；熊果酸购于中国食品药品检定研究院（批号：20140224），白色粉末，纯度＞98%，应用时以含5 g/L羧甲基纤维素钠的PBS溶液（pH=7.4）分别配制成熊果酸10，20 g/L的混悬液；盐酸二甲双胍片购于天津亚宝药业科技有限公司（批号：1407034），采用水磨法，以含5 g/L羧甲基纤维素钠的PBS溶液（pH=7.4）分别配制成含二甲双胍20 g/L的混悬液；总胆固醇（CHO）、三酰甘油（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-c）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-c）试剂盒购于北京瑞正善达生物工程技术有限公司（批号：20140330）；水合氯醛购于西安藻露堂药业集团康复医药有限公司；羧甲基纤维素钠购于国药集团化学试剂有限公司（批号：20140122）。

1.3　仪器

罗氏血糖仪及试纸购于瑞士罗氏诊断有限公司；电子天平购于上海菁海仪器有限公司（型号：FA2104N）；全自动生化分析仪购于德国罗氏制药有限公司（型号：cobas-8000）；高速低温离心机购于德国Eppendorf公司（型号：5180R）。

2　方法

2.1　大鼠糖尿病模型的制备

45只雄性SD大鼠适应性喂养1 w后随机分为两组：对照组8只，造模组37只。对照组给予普通饲料喂养，造模组给予高脂饲料喂养，所有大鼠自由饮水、进食。高脂饲料喂养4 w后，禁食不禁水16 h，造模组尾静脉注射链脲佐菌素（用pH为4.5的0.1 mol/L无菌柠檬酸-柠檬酸钠溶液配成1.5%浓度）30 mg/kg，按每100 g体质量0.2 m L尾静脉注射。链脲佐菌素注射1 w后，所有大鼠取尾静脉血测随机血糖（random blood glucose，RBG），以3次RBG均≥16.7 mmol/L作为造模成功标准。

2.2　分组与给药

将符合成模标准的35只大鼠，剔除体质量较低或血糖过高的3只大鼠，余下32只，按随机数字表法分为4组，加上正常对照组共5组，每组8只。分别为：正常对照组（NCG）、模型对照组（MCG）、二甲双胍组（MFG，100 mg/kg）、熊果酸高剂量组（UAHG，100 mg/kg）及熊果酸低剂量组（UALG，50 mg/kg）。分组后，按设计灌胃给予相应药物，模型对照组与正常对照组每天灌胃同容积含5 g/L羧甲基纤维素钠的PBS溶液（pH=7.4）。各组均在上午8∶00～10∶00灌胃给药，每天1次，连续6 w。

2.3　观察及检测指标

2.3.1各组大鼠一般表征给药期间密切观察各组大鼠精神状态、活动、毛色、饮食、饮水、体质量及大小便等一般状态，每周测定体质量、进食量、饮水量一次。

2.3.2随机血糖测定分别于给药第0，2，4，6 w用血糖仪测定RBG（上午给药后30 m in）1次。

2.3.3糖耐量测定于给药6 w后（处死之前），测定灌胃葡萄糖耐量（GTT），即前一天晚上断食不断水，更换垫料，禁食16 h后，固定待测大鼠，采血针刺破尾端静脉取血，用罗氏血糖仪检测0点血糖值，之后灌胃给药，给药30 m in灌胃葡萄糖（2.5 g/kg），分别于给葡萄糖后30，60，120 min测定血糖值。根据血糖值和梯形面积求和法计算曲线下面积（AUC），其中G0，G30，G60，G120为各点血糖值。

AUC=（G0+G120）/2+G30+G60。

2.3.4血脂水平测定给药6 w后，禁食12 h，用10%水合氯醛以3 m L/kg剂量腹腔注射麻醉大鼠，经腹主动脉取血，用全自动生化分析仪测定血清中CHO，TG，HDL-c，LDL-c。

2.4　统计分析方法

实验数据以均数±标准差（x±s）表示，用SPSS 13.0软件对数据进行分析，组间差异比较采用方差分析，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

3　结果

3.1　熊果酸对糖尿病大鼠一般表征的影响

正常对照组大鼠活动自如，反应机敏，毛色白而有光泽，大便正常；糖尿病模型对照组大鼠活动自如，但反应迟钝，毛色发黄无光泽，随着时间推移，毛色枯黄和反应迟钝更明显，个别大鼠有稀便现象；与模型组比较，各用药组大鼠反应迟钝现象减轻，毛色较模型组有光泽，大便成形，色泽正常，未见其他异常现象。UAHG组与MFG组相近。

3.2　各组大鼠体质量、摄食量、饮水量动态观察

图1结果显示，NCG组大鼠体质量随时间不断增长，而各组糖尿病大鼠体质量随时间推移逐渐降低，明显低于正常对照组（P＜0.01）。其中，MCG组大鼠体质量降低最明显；与模型组比较，各给药组大鼠体质量降低较缓；UAHG组大鼠体质量变化曲线与MFG组相似，给药3 w后体质量明显高于模型组（P＜0.01）；UALG组大鼠各时间点体质量也较MCG高，但无统计学差异（P＞0.05）；3个药物干预组两两之间比较均无统计学差异（P＞0.05）。

1　熊果酸对糖尿病大鼠体质量的影响

按每公斤体质量（g/kg）计算摄食量和饮水量，在6 w观察期间，NCG组大鼠摄食量和饮水量无明显变化；MCG组大鼠摄食量和饮水量逐渐增加，明显高于正常对照组（P＜0.01）；与MCG组比较，各给药组大鼠摄食量、饮水量有一定程度降低。给药3 w后UAHG组大鼠摄食量、饮水量明显低于MCG组（P＜0.01），在饮水量上与MFG组相近，但在摄食量上高于MFG组（P＜0.01）；UALG组也能降低糖尿病大鼠摄食量和饮水量，但不明显；在第6周，UA组与MFG组在进食量上有显著统计学差异（P＜0.01），UAHG组与UALG组间无统计学意义（P＞0.05）；在饮水量上，UAHG组与MFG组无显著性差异（P＞0.05），而二者与UALG组存在显著性差异（P＜0.05）。见图2～3。

2　熊果酸对糖尿病大鼠进食量的影响

3.3　熊果酸对糖尿病大鼠RBG的影响

表1显示，给药前所有糖尿病大鼠RBG均明

图3熊果酸对糖尿病大鼠饮水量的影响显高于NCG组，给药期间NCG组大鼠随机血糖基本无变化；6 w给药期间，MCG组大鼠RBG略有升高；各给药组大鼠RBG有不同程度的降低，其中，MFG组降低作用最明显（P＜0.05或P＜0.01）；其次为UAHG组，其各点血糖值与MFG组相近，二者无统计学差异（P＞0.05）；UALG组对糖尿病大鼠RBG值也有降低作用，但与MCG组间无统计学差异（P＞0.05）；UAHG组与UALG组间无统计学差异（P＞0.05）。

3.4　熊果酸对糖尿病大鼠糖耐量的影响［5］

表2为给药6 w，在禁食16 h后的糖耐量检测结果：与MCG组比较，各药物对葡萄糖负荷后的血糖升高均有不同程度的抑制。UAHG组与MFG组抑制血糖升高作用相近（P＜0.01），二者间无统计学差异（P＞0.05）；UALG组也能抑制糖负荷后的血糖升高，但弱于UAHG组（P＜0.05），与UAHG组无统计学差异（P＞0.05）。AUC由低到高依次为NCG组、MFG组、UAHG组、UALG组和MCG组。

表1　熊果酸对糖尿病大鼠RBG的影响

3.5　熊果酸对糖尿病大鼠血脂水平的影响

表3可见，MCG组大鼠血清TG、CHO和 LDL-c明显高于NCG组（P＜0.01），各药物干预组大鼠血脂各指标有不同程度的改善，以MFG组效果最明显；熊果酸可明显降低血清CHO，TG，其程度与MFG组相近，两者无统计学差异（P＞0.05）；UAHG组、UALG组与MCG组比较，则有显著差异（P＜0.01，P＜0.05）；熊果酸可显著降低LDL-c（P＜0.01），另外，熊果酸有升高HDL-c趋势，但与MCG组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

表2　熊果酸对糖尿病大鼠糖耐量的影响（mmol/L）

表3　熊果酸对糖尿病大鼠血脂水平的影响

4　讨论

糖尿病是继心血管疾病、肿瘤之后的第3大疑难疾病，据统计，世界糖尿病患者人数已近4亿，而中国的糖尿病患者人数也近1亿，已成为糖尿病患病率最高的国家，并且患病人数每年都在增加［6］。糖尿病患者的长期高血糖致使糖脂代谢发生紊乱，进而诱发多种微血管并发症，全身多系统损害以及各种急慢性并发症，主要包括心血管疾病、肝脏损伤、糖尿病肾病、视网膜病变及糖尿病神经性病变等，严重影响人类的身体健康、精神和生活质量［7-11］。

本实验采用高脂饲料喂养4 w，结合单次尾静脉注射30 mg/kg STZ建立糖尿病大鼠模型，1 w后大鼠3次RBG均≥16.7 mmol/L。与NCG组相比，MCG组大鼠体质量显著减轻，摄食量、饮水量明显增加，符合糖尿病“三多一少”（多食、多饮、多尿、体质量减轻）的消耗体征，并且反应迟钝，毛色黯淡，符合糖尿病的发病特点。

熊果酸是一种α-香树脂醇型五环三萜类化合物，在自然界植物中分布极为广泛，具有抗糖尿病、抗肿瘤、护肝、抗炎抑菌等多种药理用途［12］。熊果酸的降糖机制可能为增加糖代谢关键酶GCK的含量和GCKmRNA表达，将血糖酵解为其他糖代谢产物；抑制α-葡萄糖苷酶活性，减少葡萄糖吸收；保护胰腺β-细胞并刺激胰岛素分泌；激动胰岛素受体TGR5和抑制蛋白络氨酸磷酸酶1B，促进组织摄取和利用葡萄糖［13-15］。本实验结果表明，熊果酸可显著降低RBG，改善葡萄糖耐量使AUC减小，其中以高剂量效果最佳（P＜0.01或P＜0.05），可能与熊果酸增加GCK表达，降低α-葡萄糖苷酶活性，促进胰岛素释放及影响胰岛素信号转导有关。

糖代谢与脂代谢相通，两者关系中，原发性改变为高糖血症，继而引起高脂血症。糖酵解产物可合成脂肪，脂肪分解的产物也可通过糖酵解和糖异生途径合成葡萄糖或糖原，因此糖脂代谢共同调节血糖水平［16］。熊果酸改善糖脂代谢的机制可能为上调原癌基因Cb1相关蛋白（CAP）表达来抑制3T3-L1脂肪细胞分化并改善其糖代谢；拟胰岛素作用；促进过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR）-α表达以及调控脂肪细胞PPAR-γ表达和分化，调控脂质合成、代谢和转运的各种关键酶基因的表达；激动G蛋白偶联胆汁酸受体TGR5，从而稳定体内葡萄糖、脂质的平衡［17-18］。本实验结果中，熊果酸可使血清中CHO、TG显著下降（P＜0.05，P＜0.01），低剂量可明显降低LDL-c（P＜0.01）。表明熊果酸具有改善糖脂代谢的作用，其机制可能是通过其拟胰岛素作用，调控PPAR表达，激动胆汁酸受体TGR5。

综上所述，熊果酸能显著改善糖尿病大鼠一般表征和糖脂代谢紊乱，可以尽早终止糖脂毒性造成的恶性循环，但其具体的作用部位和机制，尚待进一步研究。

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Effect of Ursolic Acid on General Characteristics as well as G lucose and Lipid M etabolism in Diabetic Rats

Shi Yajing1， Zhang Huan1， Li Yuncui1， Chen Xuepin1， Cheng Xishuang1， Lv Zhiwei2， Qi Yajuan1，3， Han Shuying1,3
（1 North China University of Science and Technology Basic Medical Science ， Hebei Tangshan 063000，China；2 Dean's Office of North China University of Science and Technology；3 Hebei Key Laboratory for Chronic Diseases，Tangshan Key Laboratory for Preclinical and Basic Research on Chronic Diseases， School of Basic Medical Sciences， North China University of Science and Technology）

Objective：To investigate the effect of ursolic acid（UA）on the general characteristics as well as glucose and lipid metabolism in diabetes mellitus（DM）rats induced by high fat diet and streptozocin（STZ），in order to provide an experimental basis for the clinical application of UA.M ethods：Diabetic rat model was established by feeding w ith high-fat diet for 4 weeks plus a single injection w ith STZ（30 mg/kg）in caudal veins. Rats were random ly divided into normal control group（NCG），model contrl group（MCG），metformin group （MFG，100 mg/kg），high-dose ursolic acid group（UAHG，100 mg/kg）and low-dose ursolic acid group （UALG，50 mg/kg），eight for each.The rats in NCG and MCG groups were adm inistered orally w ith PBS，while those in the other three groups w ith the corresponding drugs，once a day for 6 weeks，of which the body mass，food intake and water intake were monitored once a week，and random blood glucose（RBG）every 2 weeks.Glucose tolerance test（GTT），serum total cholesterol（CHO），triglycerides（TG），high-density lipoprotein cholesterol（HDL-c）and low density lipoprotein cholesterol（LDL-c）were determination at the end of the experiment.Results：Compared w ith those in MCG group，the food intake，water intake，RBG and area under the curve of blood glucose（AUC）decreased significantly（P＜0.05 or P＜0.01），while the decrease of body mass was inhibited，and OGTT was improved.However，the serum CHO and TG levels in UAHG and UALG groups （P＜0.05 or P＜0.01）as well as LDL-c in UALG group（P＜0.01）decreased significantly.Conclusion：Ursolic acid improved the general characteristics，decrease the blood sugar and lipid，and corrected the glucolipid metabolic disorders in diabetic rats.

Ursolic Acid；Diabetes；Characteristics；Sugar and Lipid Metabolism；Blood Sugar；Blood Lipid

10.3969/j.issn.1672-5433.2016.07.005

国家自然基金（81471022）；唐山市科技重点项目（10130203-3）；华北理工大学大学生创新实验计划项目（X201510081006）

石亚静，女，本科在读。研究方向：糖尿病。
韩淑英，女，硕士，硕士生导师。研究方向：中药防治糖尿病。通讯作者E-mail：shuyinghan@126.com

2016-03-11）