勃氏甜龙竹活体竹汁成分及微生物的研究

杨瑞娟，王桥美，季爱兵，邓杰文，严 亮

(1.普洱茶研究院，普洱 665000； 2.普洱滇润农业科技有限公司，普洱 665000)

勃氏甜龙竹活体竹汁成分及微生物的研究

杨瑞娟1，王桥美1，季爱兵1，邓杰文2，严 亮1

(1.普洱茶研究院，普洱 665000； 2.普洱滇润农业科技有限公司，普洱 665000)

研究从勃氏甜龙竹中提取新鲜竹汁，检测了其农残、矿物质元素、氨基酸的含量；并对新鲜竹汁进行过滤除菌，对比分析过滤前后竹汁中微生物的变化，研究其保质期。实验结果显示：勃氏甜龙竹农残未超标，矿物质元素和氨基酸含量丰富；从新鲜竹汁中分离得到36株菌株，均为细菌，主要属于Acinetobacter,Arthrobacter,Bacterium,Cedecea,Enterobacter,Pantoea,Pseudomonas,Sphingomonas和Stenotrophomonas9个属；从过滤膜表面分离得到37株菌株，种类与新鲜竹汁中的主要微生物基本一致；过滤除菌后未检测出微生物；从过滤后变质的竹汁中分离得到21株菌株，属于Acinetobacter,Bacillus和Brevibacterium3个属；过滤法能除去竹汁中的主要微生物，可以延长新鲜竹汁的保质期。

活体竹汁；过滤除菌法；微生物

竹，属禾本科，竹亚科，多年生常绿乔木状植物，无规律的分布于亚热带、热带及温带地区[1]。全球竹类植物约有70多属1 200多种，在禾本科植物中种类最多[2]。中国是竹之乡，竹资源的种类、产量、适应性均是世界领先[3]，但竹资源的利用率和创造的价值很低[4]。甜龙竹(DendrocalamushamiltoniiNeesetArn.exMunro)，为禾本科竹亚科牡竹属竹种，又叫甜笋竹(中国竹谱)、甜竹。勃氏甜龙竹为笋材两用大型丛生竹，秆直立或有时外倾，高12～18 m，直径10～18 cm；节间长30～50 cm。其竹材通直，节平，坚韧、弹性强，可供编织、家具，较大的径材可加工成竹胶合板、竹装饰板及竹浆造纸等，是极具开发利用价值的优良笋用竹。

竹汁含有人体必需氨基酸、维生素、微量元素、黄铜[5-8],具有很高的药用和食用价值。竹汁中药名竹沥，早已作为药物用于中医临床[9]。具有清热解毒、镇静止咳、延缓衰老的功效[10]。活体竹汁澄清透明，竹香淡雅，爽口怡人，具有良好的天然性、营养性和安全性，是生产竹汁饮料良好的原材料。但是，由于鲜竹汁的采集在户外进行[11]，竹汁受污染程度较重，加上竹汁本身存在许多微生物，极易导致竹汁饮料短时间内即产生沉淀、混浊、失光等劣变现象，严重影响到产品质量及商品价值[12]。

相对于麻竹、毛竹、雷竹等竹种，国内对甜龙竹的研究较少，本文检测了勃氏甜龙竹活体竹汁的成分，并结合传统形态分类鉴定方法与现代分子生物学技术，对勃氏甜龙竹竹汁平板培养过程中反复出现的微生物进行分离和鉴定，得到了甜龙竹新鲜竹汁的内含菌种库，还通过过滤除菌法除菌，延长了新鲜竹汁的保质期，且分析了过滤处理后变质的竹汁的菌种组成，为勃氏甜龙竹竹汁在食品、药品、化妆品、保健品等产业中的应用提供了基础数据，开发前景十分广阔，将带来良好的社会效益和经济价值。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

本实验所用竹汁采自云南普洱滇润农业科技有限公司大寨甜龙竹种植基地。

LB培养基：胰蛋白胨10 g·L-1、酵母提取物5 g·L-1、氯化钠10 g·L-1、琼脂18 g·L-1。

YEPD培养基：酵母粉10 g·L-1、蛋白胨20 g·L-1、葡萄糖20 g·L-1、琼脂18 g·L-1。

察氏培养基：硝酸钠3 g·L-1、磷酸氢二钾1 g·L-1、硫酸镁0.5 g·L-1氯化钾0.5 g·L-1、硫酸亚铁0.01 g·L-1、 蔗糖30 g·L-1、 琼脂20 g·L-1。

MARS培养基:葡萄糖20 g·L-1、蛋白胨10 g·L-1、牛肉膏10 g·L-1、酵母膏5 g·L-1、柠檬酸氢二胺2 g·L-1、吐温80 1 mL/L、乙酸钠5 g·L-1、磷酸氢二钾2 g·L-1、硫酸镁0.58 g·L-1、硫酸锰0.25 g·L-1、琼脂18 g·L-1。

1.2 仪器与设备

LDZX-50KB型立式压力蒸汽灭菌锅；DHP-9162型电热恒温培养箱；相机；苏净安泰SW-CJ-2F型洁净工作台；376000 型漩涡震荡仪；威泰克掌上离心机;BS-30KA型电子天平； XS204型电子天平；9700型PCR仪；EM-308EB1型微波炉；dyy-6C型电泳仪；SYNGENE GBOX型凝胶成像系统；MDF-382E(N)超低温冰箱；BCD-218SDA型冰箱；LGJ-1冷冻干燥机；HVLP14250表面滤膜，孔径0.45 μm；GVWP14250滤膜，孔径0.22 μm；07528-30蠕动泵数显驱动器；YY3014236不锈钢平板式过滤器。

1.3 方法

1.3.1 竹汁的活体取样及处理 竹子活体取水技术[13]：用电钻在竹子节部打一个穿透竹内腔薄膜的洞，待竹汁流出一段时间后，用无菌细管一端插入竹子干内部，另一端插入无菌瓶子中，收集从小孔流出的天然竹汁。

1.3.2 竹汁除菌处理 甜龙竹的活体活体取水技术在竹林中进行，露天采集过程中竹汁中不可避免地带有大量的微生物及杂质，因此，首先要进行除杂除菌处理，采集后的竹汁经过滤除菌处理后保存食用。本实验采用过滤除菌法[14]，即先用灭菌过的纱布过滤除杂，再用微小孔径的薄膜(0.45 μm和0.22 μm)通过物理阻留的方法以达到无菌的目的，本方法一般适用于血清、毒素、抗生素等不耐热生物制品及空气的除菌。

1.3.3 竹汁理化性质分析 (1)农药残留量的测定：GB2763-2005《食品中最大农药残留限量》。(2)矿物质元素的测定：GB/T 5750.12-2006生活饮用水标准检验方法；GB/T8538-2008饮用天然矿泉水检验方法。(3)游离氨基酸总量测定：GB/T8314-2013。

1.3.4 菌种分离培养 (1)液体菌种分离培养。取1 mL竹汁装入1.5 mL灭菌离心管中，用无菌水稀释为10-1、10-3两个梯度的菌悬液，涂布到LB培养基、YEPD培养基、察氏培养基、MARS培养基上，置于37℃恒温培养72 h后对菌种进行拍照、计数、描述。挑取典型微生物单菌落进行划线纯化培养，并进行测序鉴定和菌种保存。(2)滤纸表面菌种分离培养。用灭菌的牙签挑取过滤竹液后留在滤纸表面的残留物，放入1.5 mL灭菌离心管中，用无菌水稀释为10-1、10-3、10-5三个梯度的菌悬液，将菌悬液涂布到LB培养基、YEPD培养基、察氏培养基、MARS培养基上，置于37℃恒温培养72 h后对菌种进行拍照、计数、描述。挑取典型微生物单菌落进行划线纯化培养，并进行测序鉴定和菌种保存。(3)平板计数：平板培养计数法[15]。

1.3.5 菌种的鉴定 将纯化的真菌制成菌悬液[16]，真菌PCR体系(50 μL)如下：2×PCR buffer for KOD FX 25 μL 、2 mm dNTP mixture 10 μL、KOD FX(TOYOBO，日本)(1.0 U·μL-1)1 μL、上游引物(10 μmol·L-1)2 μL、下游引物(10 μmol·L-1)2 μL、菌悬液1.5 μL、水8.5 μL；PCR反应条件：(1)预变性94℃ 5 min；(2)变性98℃ 10 s；(3)复性(退火)50℃ 30 s；(4)延伸68℃ 2 min，步骤(2)-(4)循环45次；(5)4℃保温；上游引物NL1F：5′ GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG3′ 下游引物LS2R：5′ ATTCCCAAACAACTCGACTC3′。

将纯化的细菌制成菌悬液[17]，细菌PCR体系(50 μL)如下：10×Taq buffer 5 μL、2 mm dNTP mixture 5 μL、Taq酶(5.0 U·μL-1)1 μL、上游引物(10 μmol·L-1)2 μL、下游引物(10 μmol·L-1)2 μL、菌悬液2 μL、水33 μL；PCR反应条件：(1)预变性94℃ 5 min；(2)变性96℃ 30 s；(3)复性(退火)52℃ 30 s;(4)延伸72℃ 50 s，步骤(2)-(4)循环35次；(5)72℃延伸10 min;(6)4℃保温；上游引物R1492：5′ TACGGYTACCTTGTTACGACTT3′；下游引物F27：5′ AGAGTTTGATCMTGGCTCAG3′。

将PCR扩增产物送至广州华大基因测序。根据测序结果，用每个菌株的ITS1基因作为靶序列，在GenBank数据库中用在BLAST(BasicLocalAlignmenSearchTool)程序来搜索同源序列，挑选与靶系列最相近的参考菌株系列，查出相应微生物，完成菌种鉴定。

2 结果与分析

2.1 竹汁理化分析结果

2.1.1 竹汁农残检测结果 农残指数：经普洱市质量技术监督综合检测中心检测，敌敌畏、甲胺磷、乙酰甲胺磷、六氯苯、甲拌磷、氧化乐果、α-六六六、五氯硝基苯、久效磷、γ-六六六(林丹)、异稻瘟净、β-六六六、乐果、七氯、八氯二丙醚、百菌清、δ-六六六、甲基毒死蜱、艾氏剂、甲基对硫磷、三唑酮、毒死蜱、氟虫腈、马拉硫磷、杀螟硫磷、对硫磷、三氯杀螨醇、倍硫磷、水胺硫磷、速克灵(腐霉利)、喹硫磷、α-硫丹、p,p′-DDE、噻嗪酮、狄氏剂、杀扑磷、异狄氏剂、o,p′-DDT、乙硫磷、p,p-DDD、β-硫丹、布洛芬(肟菌酯)、p,p′-DDT、克螨特-1、克螨特-2、联苯菊酯、硫丹硫酸盐、三唑磷、甲氰菊酯、氯氟氰菊酯(三氟氯氰菊酯)、喹螨醚、苯硫磷、三氯杀螨砜、亚胺硫磷、氯菊酯-1、氯菊酯-2、哒螨灵、氟氯氰菊酯-1、氟氯氰菊酯-2、氟氯氰菊酯-3、氯氰菊酯-1、氯氰菊酯-2、氯氰菊酯-3、氟氰戊菊酯-1、氟氰戊菊酯-2、氟胺氰菊酯-1、氟胺氰菊酯-2、氰戊菊酯、顺势氰戊菊酯、溴氰菊酯、苯醚甲环唑等农残物在竹汁中均未检出。

2.1.2 竹汁矿物质元素检测结果 根据GB/T 5750.12-2006 生活饮用水标准检验方法和GB/T 8538-2008饮用天然矿泉水检验方法的标准对活体竹汁进行检验。

表1 竹汁中矿物质元素组成

由表1可知，金属元素含量较丰富，有人体必需元素Fe、Ca、Zn、Cu、Ni等，也有微量元素Ni、Cr、Se等； K、Ca、Mg 、CL-、SO42-、NO3-等矿物元素含量较高，Ba、Fe、Sr、Zn、Na、Cu、Al等次之，有毒元素As、Hg、Sb、Sn、Pb、Li、Ag含量不高，接近或小于国标含量，符合GB/T 5750.12-2006生活饮用水标准和GB/T 8538-2008饮用天然矿泉水检验标准。由于矿物元素之间的拮抗作用，单一元素硒(Se)，可以拮抗体内重金属汞(Hg)、铅(Pb)、镉(Cd)、银(Ag)、砷(As)，结合后再以“排毒机制”一起排出体外，以避免重金属对人体的毒害。由于矿物元素之间的相乘(协同)作用，铜(Cu)可以促进铁(Fe)的运送，加速红血球的合成。这些微量元素可以调节人体酸碱值，既可作为营养素，又在生物有机体中起催化、激活动力的作用。

2.1.3 竹汁氨基酸检测结果 由表2可知，竹汁中氨基酸种类丰富，共检测出10种氨基酸，氨基酸含量较丰富，含有人体必需氨基酸3种，含量分别为赖氨酸21 mg·L-1、苏氨酸12 mg·L-1、缬氨酸3 mg·L-1。含有非必需氨基酸7种。谷氨酸和丝氨酸含量最多，分别为88 mg·L-1和26 mg·L-1，这两种氨基酸分别是呈鲜味和呈甘味的特征氨基酸，丰富的谷氨酸和丝氨酸使竹汁有较好的口感。苏氨酸和脯氨酸的含量分别为12 mg·L-1和4 mg·L-1，这两种氨基酸未在单云[18]等研究中检测出，这说明不同地方的甜龙竹竹汁成分是有差别的。

表2 竹汁中氨基酸组成

表3 新鲜竹汁内含微生物的组成

2.2 竹汁内含微生物的组成

竹汁会因微生物的作用而逐渐变浑沉淀，色泽不断加深，因此，采集后的竹汁应及时投入处理进行微生物的分离鉴定，时间间隔不应超过4 h，否则风味劣变进而丧失其加工特性。

由表3可知，从新鲜竹汁中分离得到36株菌株，全部鉴定为细菌，分别属于Acinetobacter,Arthrobacter,Bacterium,Cedecea,Enterobacter,Pantoea,Pseudomonas,Sphingomonas和Stenotrophomonas9个属，其中Acinetobacter,Arthrobacter,Enterobacter,Sphingomonas和Stenotrophomonas5个属的微生物种类较多，Acinetobacter为不动杆菌属，广泛分布于外界环境中，主要在水体和土壤中，易在潮湿环境中生存；Arthrobacter为节杆菌属，革兰氏阳性，不生孢，不抗酸，好氧，化能异养菌，最适生长温度20～35℃，广泛分布于环境，主要是土壤。Enterobacter为肠杆菌属，广泛分布于自然界，普遍存在于人和动物中；Sphingomonas是一类丰富的新型微生物资源，可用于芳香化合物的生物降解；Stenotrophomonas广泛存在于水，土壤，动物体内。

2.3 过滤除菌法对竹汁微生物的影响

对于污染水平较高的水系统来说，平皿法和薄膜过滤法的计数结果并无显著性差异，且平皿法有费用低，检测方法简便的优势， 因此， 在微生物污染水平较高的水系统采用平皿法即可得到准确数据[19]。

由表4可知，新鲜竹汁的微生物含量为1.0×104个·mL-1，经过滤除菌法处理的竹汁未检测出微生物。未过滤竹汁的微生物数量增加快，一周后无色澄清透明的竹汁常温保存就呈浅黄色，浑浊状态，三周后冷藏条件下的竹汁亦呈浅黄色，浑浊状态，两个月后常温保存的竹汁中的微生物数量已无法计数；过滤处理过的竹汁四周后常温保存条件下开始滋长微生物，两个月后常温与冷藏条件下均能检测出微生物，常温保存的竹汁变浅黄色并浑浊，而冷藏保存的竹汁还是无色澄清透明状态。由此而知，竹汁的冷藏保存效果好，常温保存效果差，过滤处理可以明显延长竹汁的保质期，对保证竹汁饮料连续化生产十分重要。

表4 竹汁保存过程中微生物数量的变化

2.4 过滤膜表面微生物组成

竹汁是一个复杂的成份体，体系的组成及特性影响到沉淀产生的数量及速率。在弱酸性时由于带正电荷的蛋白质、带负电荷的多酚类物质及多糖两者之间以及多酚自身的聚合。往往导致竹汁在短时间内即产生大量沉淀[20]，经过纱布过滤除杂，再用0.45 μm和0.22 μm的两层薄膜过滤，对膜表面的微生物分离鉴定结果如表5。

由表5可知，从过滤膜表面分离得到37株菌株，均为细菌，分别属于Acinetobacter,Arthrobacter,Bacterium,Cedecea,Enterobacter,Pantoea,Pseudomonas,Sphingomonas和Stenotrophomonas9个属，Acinetobacter,Arthrobacter,Enterobacter,Pseudomonas,Sphingomonas和Stenotrophomonas6个属的微生物居多，其中Enterobacter易于培养，繁殖快(在适宜条件下每20～30min可增殖1代)，可以在人、动物、植物体内寄生或共生，也可在土壤或水中生存，通过过滤去除，可以明显增加竹汁保质期。

表5中的9个属微生物跟表3完全吻合，说明平板过滤器达到了过滤除菌的目的，但是表5与表3中菌株种类与数量有微小差别，原因是竹汁中的优势菌群容易在过滤膜表面凝集，经稀释培养更容易存活，如Arthrobacterwoluwensisstrain和Stenotrophomonasnitritireducensstrain，而含量少的微生物是弱势菌群，更不容里分离鉴定得到，如BacteriumsymbiontofBactroceracorrectastrain。

2.5 过滤后变质竹汁的微生物组成

新鲜竹汁竹味淡雅，滋味柔和，经过滤除菌后呈无色澄清透明状态，封闭保存，待竹汁颜色泛黄浑浊有变质倾向后，分析其内含微生物，结果如表6。

由表6可知，从过滤后变质竹汁中分离得到21株菌株，主要是Acinetobactercalcoaceticus,Acinetobacteroleivorans,Bacillusmuralis,Bacillussimplex,Bacillusthuringiensis和[Brevibacterium]frigoritolerans，分别属于Acinetobacter,Bacillus和Brevibacterium3个属，微生物组成比较简单。Acinetobactercalcoaceticus主要分布在水体和土壤中，易在潮湿环境中生存，粘附力极强，易在各类医用材料上粘附，可能成为贮菌源。Bacillusthuringiensis广泛分布在土壤及腐败的有机物中，是一种包括许多变种的产晶体芽孢杆菌，可做微生物源低毒杀虫剂。[Brevibacterium]frigoritolerans是在冷藏变质竹水中分离得到，顾名思义，是一类耐寒短杆菌，属于放线菌目。经过过滤除菌，之后封闭保存，在无外界污染的条件下，竹汁变质后只是口感色泽等出现了细微变化，并没有分离得到对人体危害极大的微生物种类，这也正说明过滤除菌法适用于竹汁等液体类的生物制品。

表5 过滤膜表面微生物的组成

表6 过滤后变质竹汁的微生物组成

3 结论与讨论

甜龙竹活体竹汁农残未超标，矿物质元素和氨基酸含量丰富，具有良好的天然性、营养性和安全性，是生产竹产品良好的原材料。由于钙、镁、铁可以与竹汁中的草酸、蛋白质、多酚类物质及多糖等结合导致竹汁的浑浊与沉淀[12]，竹汁品质劣变的速度快，竹汁很容易产生褐变，本文从新鲜竹汁中分离得到36株菌株，微生物种类和数量居多，这些微生物的存在更加剧了新鲜竹汁的变质速度，通过过滤，从平板过滤器过滤膜表面分离得到的37株菌株，与新鲜竹汁中的主要微生物基本吻合，说明平板过滤器达到了过滤除菌的目的。过滤除菌法可以减少竹汁

产生沉淀的不稳定因素，既可保证竹汁的澄清透明，又可保证竹汁色香味的稳定性，还可以明显延长竹汁保质期，对保证竹汁饮料连续化生产十分重要。竹汁保存过程中微生物数量的变化实验表明，竹汁的冷藏保存效果好，常温保存效果差，建议采用冷藏保存。

从过滤后变质竹汁中分离得到21株菌株，主要属于Acinetobacter,Bacillus和Brevibacterium3个属，微生物组成比较简单,与新鲜竹汁中的微生物不一致，说明过滤除菌法除菌技术比较彻底。变质竹汁中的微生物来源可能是：(1)存放竹汁的离心管灭菌不彻底，长期存放有利于这些污染微生物的生长。(2)竹汁是一个活的有机体，其内含有多种活性酶，主要是多酚氧化酶及过氧化物酶，极易导致竹汁产生酶促褐变[21]，长时间存放的竹汁内环境发生变化，促进了一些新的微生物的生长，比如Bacillus和Brevibacterium。

近年来，国内外对竹汁的研究十分活跃，多种以竹汁为基本原料制成的成品已在一些国家占有一席之地。在日本，用箬竹叶提取的竹汁治疗包括癌症在内的多种疾病，并取得很好的效果，同时还用竹汁制成多种保健品。德国人更早是直接将竹汁添加到牛奶中饮用。我国竹资源丰富，具有制取竹汁的传统经验，再加上竹子活体取水新技术的开发应用，竹产品的研究和开发具有广阔的前景和巨大的经济意义。

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Components and Microorganisms in Juice from LivingDendrocalamusbrandisii(Munro)Kurz

YANG Rui-juan1，WANG Qiao-mei1，JI Ai-bing1，DENG Jie-wen2，YAN Liang1

(1.Puer Tea Institute，Puer 665000，Yunnan，China；2.Dianrun Agriculture Technique Co.,LTD，Puer 665000，Yunnan，China)

Fresh bamboo juice was extracted from livingDendrocalamusbrandisii(Munro)Kurzfor analysis of pesticide residues，mineral elements，and amino acids. Microorganisms in the bamboo juice before and after filtration were compared to determine the shelf life. The experimental results showed that the pesticide content remained in the juice ofDendrocalamusbrandisii(Munro) Kurz was standards-compliant，and the juice was rich in mineral elements and amino acids. 36 bacterial strains were isolated from fresh bamboo juice， belonging to the genus ofAcinetobacter，Arthrobacter，Bacterium，Cedecea，Enterobacter,Pantoea，Pseudomonas，SphingomonasandStenotrophomonasrespectively. 37 bacterial strains were isolated from the surface of filter membrane，essentially the same as those in fresh bamboo juice，no microorganisms were isolated after filtration. 21 strains were isolated from metamorphic bamboo juice， belonging to the genus ofAcinetobacter,BacillusandBrevibacteriumrespectively. Filtration can remove the main microorganisms and extend the shelf life of fresh bamboo juice.

Bamboo juice；Sterilization by filtration；Microorganisms

2016-03-28

云南省普洱市科技计划项目(编号：2013kj93)

杨瑞娟(1985-)，女，山西长治人，硕士，助理研究员，主要从事微生物与生化药学研究。通信作者：严亮(1983-)，男，吉林长春人，博士，副研究员，主要从事细胞生物学研究。E-mail：jacky_4680@163.com