益气养阴祛瘀中药对干燥综合征模型NOD小鼠TLR/IFN/BAFF通路的作用研究

李霄鹏 王新昌 白秋兰 雷 艳

益气养阴祛瘀中药对干燥综合征模型NOD小鼠TLR/IFN/BAFF通路的作用研究

李霄鹏1王新昌1白秋兰2雷 艳2

目的观察益气养阴祛瘀中药对干燥综合征（SS）模型NOD小鼠外周血单个核细胞TLR9、IFN-α、BAFFmRNA表达水平的调节作用，探讨其对SS的TLR-IFN-BAFF通路信号表达的影响及其作用机制。方法选择NOD小鼠20只及ICR正常小鼠10只，饲养于无特殊病菌的恒温环境。NOD小鼠随机分为模型组、中药组，各10只，ICR正常小鼠10只，作为对照组。于小鼠9周龄时开始每日定时灌胃益气养阴祛瘀中药1次，持续12周。于实验第12周末时所有小鼠股动脉取血后处死，分离外周血单个核细胞，采用RT-PCR法检测TLR9、IFN-α、BAFF mRNA表达水平。小鼠股动脉取血后处死，摘取小鼠颌下腺，用光镜下观察小鼠颌下腺病理改变。结果对照组、模型组、中药组TLR9 mRNA表达水平分别为（0.15±0.03）、（0.92±0.05）、（0.29±0.06）；对照组、模型组、中药组IFN-α mRNA表达水平分别为（0.12±0.03）、（1.48±0.04）、（0.20±0.03）；对照组、模型组、中药组BAFF mRNA表达水平分别为（0.23±0.06）、（1.28±0.04）、（0.38±0.06）；与正常对照组相比，模型组TLR9、IFN-α、BAFFmRNA均明显升高（P＜0.01或P＜0.05），与模型组比较，中药组TLR9、IFN-α、BAFFmRNA均明显下降（P＜0.05）。结论NOD小鼠存在血清TLR9、IFN-α、BAFF mRNA水平过度表达。益气养阴祛瘀中药对NOD小鼠TLR/IFN/BAFF通路的过度表达具有抑制作用。

NOD小鼠；干燥综合征；性激素；益气养阴祛瘀；中药；TLR9；IFN-α；BAFF

干燥综合征（sjogren syndrome，SS），是一种主要累及全身外分泌腺的慢性自身免疫性疾病，发病率较高[1]。属于中医“燥痹”范畴。益气养阴祛瘀法是本课题组经多年临床应用证实疗效确切的中医治疗法则，前期研究[2-4]表明，不仅能整体调节SS患者和自发性干燥综合征模型NOD小鼠的免疫功能，而且对SS患者口眼干燥的临床症状和对NOD小鼠的唾液分泌量、颌下腺损伤指数以及局部免疫炎症微环境也有明显的改善作用。现使用益气养阴祛瘀中药对干燥综合征样小鼠治疗NOD小鼠，通过检测TLR9、IFN-α、BAFF的mRNA表达水平，进一步探讨益气养阴祛瘀中药对SS模型NOD小鼠TLR/IFN/BAFF信号转导通路的影响。

1 实验材料

1.1 实验动物20只NOD小鼠（动物合格证号：SCXK（沪）2007-0005）及10只ICR正常小鼠（SCXK（沪）2008-0016），雌性，8周龄，SPF级，均购自上海斯莱克动物实验中心。

1.2 药物益气养阴祛瘀方由生地、玄参、麦冬、石斛、白芍、黄芪、丹参、益母草组成（购自浙江中医药大学中药厂），冷水浸泡药材2h，常规两煎，第1次1.5h，第2次1h，两次水煎液混合并过滤，经水浴蒸发浓缩成含生药1.47g/mL的药液，高压灭菌后冷藏备用。

1.3 试剂PBS缓冲液，杭州吉诺生物技术有限公司；淋巴细胞提取液，武汉博士德生物工程有限公司；RNA提取试剂（TaKaRa），大连宝生物工程有限公司；逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)试剂盒，大连宝生物工程有限公司；DNA-Marker，大连宝生物工程有限公司；琼脂糖，基因科技（上海）有限公司；引物（TLR、IFN、BAFF上下游引物），生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.4 主要实验仪器电泳仪（北京六一仪器厂），紫外分光光度仪（美国PE公司），低温离心机（德国Eppendorf公司），PCR仪（德国Eppendorf公司），凝胶图像分析系统（上海嘉鹏科技有限公司）。

2 实验方法

2.1 动物分组8周龄NOD小鼠20只适应性喂养1周后，随机分为中药组和模型组，每组10只；8周龄ICR正常小鼠10只作为对照组。

2.2 给药与标本采集于小鼠9周龄开始每天上午定时给药1次，持续12周。其中中药组给予益气养阴祛瘀中药水煎剂0.2mL/10g灌胃（1.47g/mL）；模型组和对照组分别给予生理盐水0.2mL/10g灌胃。给药量均按动物与人等效剂量换算表计算。治疗后各组小鼠股动脉取血后处死，摘取颌下腺进行检测。

2.3 RNA提取和RT-PCR检测采用Trizol试剂提取NOD小鼠外周抗凝血中的总RNA后立即采用RT-PCR试剂盒进行逆转录聚合酶链式反应(RTPCR)。TLR9、IFN-α、BAFF基因序列经循环扩增30次；TLR9上下游引物序列分别为：上游：5'-CCTTGAT CTCCAACCGTAT-3'和5'-GTAGCAGTTCCCGTCCAT -3'；IFN-α上下游引物序列分别为：5'-GCATGGAAT ACAACCCCT-3'和5'-CCAGCACATTGGCAGA-3'；BAFF上下游引物序列分别为：5'-TCGTGGAATGGAT GAGTC-3'和5'-GGACATCGCTGTGAAACT-3'。PCR产物加溴酚蓝后在70V电压下经加1%琼脂糖凝胶电泳成像，与标准分子量比较，在紫外灯下观察，出现橙红色均一条带为阳性。实验中同时予β-actine引物作对照。用凝胶图像分析软件分析电泳条带的吸光度（A）值，分别以TLR9、IFN-α、BAFF与βactinA值的比值×100%表示TLR9、IFN-α、BAFFmRNA的相对表达水平。

2.4 颌下腺组织病理学观察三组小鼠处死后，分离颌下腺，以40%的多聚甲醛固定，经酒精逐级脱水，二甲苯透明后石蜡包埋，最后切成5μm厚的薄片，HE常规染色。光镜下观察颌下腺病理改变。

2.5 统计学方法应用SPSS13.0软件包，数据以均数±标准差（x±s） 表示，采用单因素方差分析，P＜0.05示差异有统计学意义。

3 实验结果

3.1 各组小鼠颌下腺组织TLR9、IFN-α、BAFF表达水平比较与正常对照组比较，模型组TLR9、IFN-α、BAFF均明显升高（P＜0.05）。与模型组比较，中药组TLR9、IFN-α、BAFF水平，明显降低（P＜0.05）。见表1、图1（插页）。

3.2 各组小鼠颌下腺组织病理观察结果正常对照组小鼠颌下腺间质中未见明显淋巴细胞浸润，导管未见扩张。模型组小鼠颌下腺间质可见淋巴细胞浸润，部分为灶状聚集，腺管周围可见纤维增生，腺泡大小不均一。中药组颌下腺间质偶见淋巴细胞浸润，未见腺体破坏（见插页图2）。

表1 各组小鼠外周血单个核细胞TLR9、IFN-α、BAFFmRNA表达水平比较（x±s）

4 讨论

干燥综合征是常见的结缔组织病之一，其免疫病理本质是患者在遗传易感性的基础上，局部的非特异性感染等因素诱导引发一系列局部和全身的免疫反应，进一步导致患者免疫调节机制的紊乱、炎症迁延，最终使得外分泌腺受到损伤。研究证实，TLR7、9在原发性干燥综合征（primary sjo¨gren syndrome，pSS）患者腮腺组织中高表达[5]，pSS患者腮腺、血浆和血细胞中IFN-α的表达均呈上调趋势[6]，pDC强烈表达TLR7和9，激活后可产生大量的IFN-α[7]。IFN-α刺激可使pSS患者涎腺上皮细胞和血液中单核细胞BAFF mRNA水平明显增高[8-10]。综上所述，TLRIFN-BAFF信号通路是贯穿疾病发生发展的重要致病轴，该信号通路的上调是SS发病的重要机制。通过抑制TLR-IFN-BAFF信号通路的信号转导，可有效阻止自身抗体和免疫复合物的产生，从而达到抑制SS自身免疫性炎症反应，减少发病或者减轻外分泌腺及其他相关系统的病理损伤。

NOD小鼠自发性涎腺炎通常从8周龄开始，16周龄开始出现明显的唾液分泌功能降低，发病率雌性大于雄性，不仅与人类SS症状相似，还有着相似的组织学及免疫学特征，是研究人类SS较理想的动物模型[11-12]。

我们认为燥毒、阴亏、瘀血为SS的主要病因，三者密切相关，相互促进，使疾病缠绵难愈。益气养阴祛瘀法合乎病机，临床效果确切，副作用较少。

本研究结果显示，益气养阴祛瘀中药组NOD小鼠血TLR9、IFN-α、BAFFmRNA水平与模型组相比具有显著差异，提示益气养阴祛瘀中药能显著降低NOD小鼠TLR9、IFN-α、BAFF mRNA表达水平。益气养阴祛瘀中药可能通过下调TLR9、IFN-α、 BAFFmRNA表达，阻断TLR9、IFN-α、BAFF之间的信号转导，调控TLR-IFN-BAFF信号通路，发挥治疗SS作用。

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（收稿：2016-05-30修回：2016-08-10）

Effects of Yiqi Yangyin Quyu Chinese Herbs on TLR/IFN/BAFF in NOD M ice w ith Sjogren Syndrome

LI Xiaopeng1,WANG Xinchang1,BAI Qiulan2,LEI Yan2.1 Department of Rheumatology,Second Hospital Affiliated to Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou(310005),China;2 Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou(310053)，China

Objective To observe the effect of Yiqi Yangyin Quyu（YYQ）Chinese medicine on the expression of TLR9,IFN-α,BAFF mRNA in peripheral blood mononuclear cells（PBMC）of NOD mice with Sjogren syndrome, in an attempt to explore the underlying mechanism of YYQ Chinese medicine on the TLR-IFN-BAFF signal pathway of Sjogren syndrome.M ethods Twenty NOD mice and 10 ICR mice were used in this study.They were fed in the environment with constant temperature and without special bacteria.NOD mice were random ly divided into 2 groups：control group（n=10）and YYQ Chinese medicine group（n=10）.Ten ICR mice served as controls. All mice were given YYQ Chinese medicine once a day from 9 week old for 12 weeks.At the end of the 12th week,blood was drawn from the arteriae femoralis and the peripheral blood monocytes cell（PBMC）were isolated from the peripheral blood and examined by reverse transcription-polymerase chain reaction（RT-PCR）analysis for the mRNA expression of TLR9,IFN-α and BAFF.Mice were then killed after blood withdrawal to obtainsubmandibular glande for pathological examination under light microscopy.Results The mRNA level of TLR9,IFN-α and BAFF in control,model,and YYQ Chinese medicine groups were as follows：0.15±0.03,0.92±0.05,0.29±0.06; 0.12±0.03,1.48±0.04,0.20±0.03;0.23±0.06,1.28±0.04,0.38±0.06;the expression of TLR9,IFN-α and BAFF mRNA in model group were all higher than those in control group（P＜0.01 or P＜0.05）and those in YYQ Chinese medicine group（P＜0.05）.Conclusion Increased expression of serum TLR9,IFN-α and BAFF are observed inNOD mice.YYQ Chinese medicine can inhibit the overexpression of TLR/IFN/BAFF pathway.

NOD mice;Sjogren's syndrome;Yiqi Yangyin Quyu（strengthening Qi,nourishing Yin,reducing stasis）;Chinese medicine;TLR9;IFN-α;BAFF

国家自然科学基金资助项目（No.81173248）

1浙江中医药大学附属第二医院风湿病科（杭州310005）；2浙江中医药大学（杭州310053）

王新昌，E-mail：ossani@126.com