云南传统乳扇制品中优质乳酸杆菌的筛选与鉴定

李周勇，陈云，史玉东，杨岚，母智深（内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司研发中心，内蒙古呼和浩特011500）

云南传统乳扇制品中优质乳酸杆菌的筛选与鉴定

李周勇，陈云，史玉东，杨岚，母智深*
（内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司研发中心，内蒙古呼和浩特011500）

从云南省洱源县邓川、江尾等地区多户白族居民家中共采集到乳扇及其酸汤样20余个，从中分离到乳杆菌39株。经试验筛选，其中3株具有优良的发酵特性，它们分别是YNEY-15、YNEY-28及YNEY-36。经16s rDNA种属鉴定与API50糖发酵试验相结合，确定YNEY-15为副干酪乳杆菌副干酪亚种3、YNEY-28为植物乳杆菌2、YNEY-36为德氏乳杆菌保加利亚亚种。将3株乳杆菌与实验室保藏的嗜热链球菌进行组合发酵，并将产品与市售酸奶进行对照，最终确定YNEY-36为目标菌株，具有继续研究成为酸奶发酵剂的可能性。

发酵特性；乳酸杆菌；分子鉴定；组合发酵

分离筛选具有优良发酵特性的乳酸菌，开发出拥有完全自主知识产权的酸奶发酵剂对我国乳品工业的发展有着十分重要的意义。乳酸菌的产酸、产黏、后酸化及产香等发酵特性对发酵乳的口感、风味、质地和营养价值有着极其重要的作用［1］。近年来，时常有学者从我国不同地区的不同传统发酵食品中分离得到具有优良特性的乳酸菌，并投入到工业生产中［2］。

云南省地域辽阔，少数民族众多，传统乳制品加工历史悠久，且制作方法繁多［3］。云南大理洱源地区的白族居民具有悠久的生产加工和食用乳扇（Dairy Fan）的历史。乳扇的制作工艺是一个典型的牛乳自然发酵过程［4］。养牛户在自产奶中加入前次生产乳扇时留下的酸汤即酸乳清作为自然发酵剂，待开始凝乳时，加热至牛奶呈半固体状态，制成扇状或条片状，在自然条件下风干，即为新制成的乳扇［5］。新制乳扇低温下保质期为30天左右，食用时可煎炒或蒸食，风味鲜香独特。试验对乳扇及其酸汤中的乳杆菌进行了分离鉴定及发酵特性研究，为乳扇中微生物的研究提供一定的数据参考。

1　材料与方法

1.1试验材料

1.1.1试剂

蒙牛原味酸奶：市售；雀巢脱脂乳粉、0.1 mol/L NaOH、甘油、结晶紫染液、酚酞、乙醇、番红染液：北京陆桥技术有限公司。

1.1.2菌株

39株乳杆菌：采自云南省洱源县邓川、江尾等地多个白族家庭自制的传统乳扇及其酸汤，使用超低温冰箱于-80℃保存；嗜热链球菌MN01：蒙牛研发中心微生物试验室保藏。

1.1.3培养基

MRS琼脂培养基、MRS液体培养基、12%脱脂乳培养基（115℃、15 min灭菌）、API50CHL糖发酵培养基：北京陆桥技术有限公司。

1.2试验设备

Premium U410超低温冰箱：美国NBS公司；CP21GⅡ高速冷冻离心机：日立公司；HV-110高压灭菌锅：日本Hirayama公司；G560E漩涡混合器：美国SCIENTIFIC Instruments公司；Sartorius pH计：北京赛多利斯仪器系统有限公司；CINAC乳品发酵监控仪：法国Alliance；LVDV-Ⅱ旋转式粘度计：美国Brookfield公司；SVE-6A1超净台：新加坡ESCO公司。

1.3方法

1.3.1乳杆菌的活化及纯化

采用浓度为12%的脱脂乳培养基三代活化冻存的39株乳杆株，并于MRS培养基上划线接种，37℃条件下培养48 h。挑取单菌落继续于MRS培养基上划线培养，革兰氏染色镜检［6］，直到确认为纯菌。采用MRS斜面培养基划线接菌培养，于4℃冰箱内保藏备用。

1.3.2优良发酵特性菌株的筛选

酸度测定方法：发酵乳样品凝乳后，经24 h后熟，采用国标规定的酸碱滴定法测定酸度［7］。

粘度测定方法［8］：采用LVDV-Ⅱ旋转式粘度计做一点式测定，经预试验探索，最终确定在4℃条件下，使用92号转子，2 r/min转速，测量10 s记数。重复3次取算术平均值，单位为mPa·s。

发酵特性筛选试验：

1.3.2.1凝乳时间

活化并纯化好的菌株按2%的接菌量接种到12%的脱脂乳内，混匀后置于43℃下恒温发酵，采用乳品发酵监控仪连续测定样品pH，以0.5 h为最小单位，记录样品pH降低到4.6及4.6以下所用的时间，即为菌株发酵脱脂乳的凝乳时间。

1.3.2.2产酸速度［9］

样品在发酵初始和15 h时，分别测定pH及酸度。计算每小时pH和酸度的平均变化量即为相应菌株的产酸速度。

1.3.2.3后酸化程度［10］

12%的脱脂乳在接菌后的发酵过程中，定点在15 h和60 h时，分别测定脱脂乳样品的pH和酸度。计算此45 h内平均每小时pH及酸度的变化量，即为菌株发酵的后酸化程度。

1.3.2.4黏度测定

根据前期试验结果，选择凝乳时间在6 h内、产酸速度快且后酸化程度相对较弱的菌株进行发酵。至样品凝乳后，取出破乳，并置于4℃条件下后熟24 h，取出采用一点式测定样品黏度。

1.3.3菌株鉴定

1.3.3.116s rDNA鉴定［11］

采用美国Promega细菌DNA提取试剂盒进行菌株的DNA提取，并进行PCR扩增。

PCR扩增：体系50 μL，反应条件为：95℃/5 min、95℃/30s、50℃/30s、72℃/1min，31个循环；75℃/5 min。收集PCR产物后，送由天津生物芯片责任有限公司进行测序并比对结果。

1.3.3.2API50辅助鉴定［12］

目前，任何一种分子生物学的方法都无法单独完成对所有乳酸菌的鉴定。必须与传统的生化试验相结合才能将鉴定结果做到最好。16s rDNA鉴定也不例外，其结果有时无法将菌株鉴定至种水平。API50CHL是由含有49种碳水化合物的试验条组成的简易型培养基，适于乳酸杆菌和相关菌的鉴定。采用16s rDNA鉴定的方法，结合API50的鉴定结果，能较好地将乳杆菌鉴定至种水平。

1.3.4组合发酵试验

将筛选出的发酵特性较好的乳杆菌与标准嗜热链球菌按1∶1的接种比例［13］，3%的接菌总量进行组合发酵。以市售蒙牛原味酸奶为参照，在样品后熟24 h后进行各项指标测定，综合评定筛选出的菌株是否具有进一步开发成为酸奶发酵剂的可能，菌株组合比例的优化在此不做研究。

1.3.4.1酸奶制作工艺［14］

牛奶（杂菌＜5×105CFU/mL）→配料加入8%白砂糖、搅拌1 h→均质（20 MPa）→高温灭菌（95℃，5 min）→冷却至42℃→接种（接种量3%）→恒温发酵（42℃）→破乳后，4℃后熟24 h。

1.3.4.2测定指标

黏稠度：粘稠度的测定采用LVDV-Ⅱ旋转式粘度计进行，通过前期预试验，选择62号转子，50 r/min，在4℃条件下，测定10 s计数。照此方法重复测量3次取平均值，黏稠度单位为mPa·s。

乳清析出率［15］：取100 g 4℃条件下贮藏的酸奶样品，倒入含120目钢丝网的漏斗中静置2 h，收集下方析出的乳清并称重。乳清析出率/%=乳清的质量（g）/样品的质量（g）×100

感官品评：由蒙牛研发中心的20名感官品评小组成员，对发酵乳样品的总体感官（包括色泽、组织状态及滋气味等）进行评价。总分高于90的，为优质酸奶；总分介于80至90之间的，为良质酸奶；总分低于80的，为次质酸奶。酸奶感官评定标准如表1所示。

表1　酸奶感官评定标准［16］Table 1　Standard of organoleptic investigation for yogurt

2　结果与分析

2.1乳杆菌分离纯化结果

试验从云南省洱源县邓川、江尾等地区多户白族居民家中共采集到乳扇及酸汤样20余个。通过革兰氏染色镜检及过氧化氢酶试验，初步确认从中分离到乳酸菌76株，其中含乳酸杆菌39株，根据菌株来源依次命名为“YNEY-”系列。经多次传代纯化以后，采用MRS斜面培养基划线接菌培养，于4℃冰箱内保藏备用。

2.2优良发酵特性菌株筛选结果

2.2.1菌株产酸试验结果

2.2.1.1凝乳时间测定结果

采用乳品发酵监控仪连续测定样品pH，对样品凝乳时间进行监控，测定结果见表2。

表2　凝乳时间测定结果Table 2　Measurement results of curd time

续表2 凝乳时间测定结果Continue table 2　Measurement results of curd time

由以上试验结果可以看出，39株乳杆菌在43℃恒温箱中发酵，共有12株菌能在6 h内发酵脱脂乳至凝乳。它们分别是YNEY-01、YNEY-06、YNEY-07、YNEY-10、YNEY-15、YNEY-16、YNEY-17、YNEY-23、YNEY-28、YNEY-31、YNEY-36、YNEY-38，各自凝乳时间从3.5 h～6 h不等。因此，保留这12个乳杆菌进行后续其它发酵特性试验并进行对比评价。

2.2.1.2产酸速度及后酸化测定结果

在固定时间点测定样品的pH和酸度，测得不同菌株产酸速度及后酸化结果如表3所示。

表3　菌种产酸速度及后酸化测定结果Table 3　Measurement results of speed of strains produce acid and degree of after acidification

由以上试验结果可以看出，产酸速度相对较快的乳杆菌共有7株，分别是YNEY-06、YNEY-07、YNEY-15、YNEY-16、YNEY-28、YNEY-31及YNEY-36。通过数据分析我们得知，它们的产酸速度和其余菌株差异显著。其中，YNEY-16和YNEY-31的后酸化度严重，酸度变化分别为1.64°T/h和1.84°T/h，与其余5株菌差异显著。因此，最终选择产酸速度快且后酸化程度弱的5株菌YNEY-06、YNEY-07、YNEY-15、YNEY-28、YNEY-36进行后续的黏度试验。

2.2.2菌株产黏结果

样品在4℃环境下后熟24 h后，黏度测定结果如表4所示。

表4 菌种黏度试验结果Table 4　Results of strains produce viscosity

通过表4可以看出，不同菌株发酵样经4℃环境后熟24 h后，黏度差异明显。YNEY-15、YNEY-28及YNEY-36发酵样的黏度较大，分别为6 842 mPa·s、6 514.5 mPa·s和7 674.5 mPa·s，经分析与YNEY-06、YNEY-07发酵样的黏度值差异显著。

根据以上结果，试验初步确认筛选出3株具有较好发酵特性的乳杆菌，分别是YNEY-15、YNEY-28及YNEY-36，它们同时具有较好的产酸和产黏特性。试验最终选择这3株菌进行鉴定，并继续下一步的混合发酵试验。

2.3菌株种属鉴定结果

2.3.1菌株16s rDNA分子鉴定结果

经16s rDNA分子鉴定，结果显示，YNEY-15与副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）的16s基因序列同源性高达100%，基本可确定为副干酪乳杆菌。YNEY-28的16s基因序列同时与戊糖乳杆菌（Lactobacillus pentosus）和植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）有着相同的99.8%的同源性，暂时无法区分其种属。YNEY-36与德氏乳杆菌（Lactobacillus delbrueckii）的16s基因序列有着高达100%的同源性，可基本确定为德氏乳杆菌。

2.3.2菌株API50发酵结果

菌株YNEY-15、YNEY-28、YNEY-36与API50 CH试验条中的49种不同可发酵碳水化合物反应，所得的反应图谱如图1所示。

根据图1中YNEY-15、YNEY-28、YNEY-36的API50反应图谱，与API50反应标准图谱对照表［17］进行比对，试验最终确定YNEY-15为副干酪乳杆菌副干酪亚种3（Lactobacillus paracasei ssp paracasei 3），YNEY-28为植物乳杆菌2（Lactobacillus plantarum 2），YNEY-36为德氏乳杆菌保加利亚亚种（Lactobacillus delbrueckii ssp.bulgaricus）。

2.3.3菌株组合发酵试验结果

将菌株YNEY-15、YNEY-28、YNEY-36与标准嗜热链球菌混合发酵，试验结果见表5。

图1菌株YNEY-15、YNEY-28及YNEY-36的API50鉴定图谱Fig.1　API50 identification map of YNEY-15、YNEY-28 and YNEY-36

表5 菌株组合发酵试验结果Table 5　Test results of strains mixed fermentation

由表5可知，3个试验组酸奶发酵样品的乳清析出率均高于参照组，但差异并不显著。YNEY-36+ MN01发酵样品的黏度略高于参照组，但无明显差异；YNEY-15+MN01和YNEY-28+MN01样品的黏度均显著低于参照组，可能是由于试验菌株和标准菌株之间产生了某种产黏拮抗作用。经试验室专业人员感官品评，YNEY-36+MN01组样品对参照样感官最相近，均评定为优质酸奶。YNEY-15+MN01和YNEY-28+ MN01组样品感官品质得分低于参照组，评定为良质酸奶。

根据上述试验结果，综合考虑样品的乳清析出率、黏度、总体感官以及今后可能用于发酵剂开发，试验最终确定YNEY-36为目标菌株，用于进一步深入研究。

3　结论

试验从云南省洱源县邓川、江尾等地区的乳扇及其酸汤样中共分离到乳杆菌39株。经试验筛选，其中3株具有优良的发酵特性，它们分别是YNEY-15、YNEY-28及YNEY-36。经16s rDNA分子鉴定与API50糖发酵试验相结合，确定YNEY-15为副干酪乳杆菌副干酪亚种3（Lactobacillus paracasei ssp paracasei 3），YNEY-28为植物乳杆菌2（Lactobacillus plantarum 2），YNEY-36为德氏乳杆菌保加利亚亚种（Lactobacillus delbrueckii ssp bulgaricus）。经菌株组合发酵试验，最终确定YNEY-36为目标菌株，可用于深入研究和工业发酵的开发。

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Screening and Identification for Lactobacillus from Traditional Dairy Fan Products in Yunnan Province

LI Zhou-yong，CHEN Yun，SHI Yu-dong，YANG Lan，MU Zhi-shen*
（Inner Mongolia Mengniu Dairy Industry（Group）Co.Ltd.R&D Center，Hohhot 011500，Inner Mongolia，China）

Test isolated 39 lactobacillus strains from 20 traditional dairy fan products and sour soup which made by several herding families in Eryuan league of Yunnan province.By test screening，3 lactobacillus with good fermentation characteristics were got，they are YNEY-15，YNEY-28 and YNEY-36.By 16 s rDNA appraisal and API50 sugar fermentation tests，determine the YNEY-15 for Lactobacillus paracasei ssp paracasei 3，YNEY-28 for lactobacillus plantarum 2 and the YNEY-36 for Lactobacillus delbrueckii ssp bulgaricus.The mixed fermentation experiment was carried out with three lactobacillus and streptococcus thermophilus，and compared with commercially available yogurt，determine the YNEY-36 for target strains eventually，as the possibility become for yoghurt starter cultures.

fermentation characteristics；lactobacillus；molecular identification；mixed fermentation

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.10.046

李周勇（1987—），男（汉），初级工程师，硕士研究生，研究方向：乳制品研究与开发。
*

母智深，副教授，主要从事乳品营养与工程方面的研究。

2015-04-07