响应面法优化葡萄籽蛋白质提取工艺

吴芳，李开雄，李应彪，陈帅，许程剑（石河子大学食品学院，新疆石河子832000）

响应面法优化葡萄籽蛋白质提取工艺

吴芳，李开雄，李应彪，陈帅，许程剑*
（石河子大学食品学院，新疆石河子832000）

为了提高赤霞珠葡萄籽的有效利用率，采用碱溶酸沉法提取葡萄籽中的蛋白质，并通过响应面法优化提取条件。在单因素试验的基础上，依据Central Composite中心组合设计原理，采用Design-Expert.8.05数据分析软件，对蛋白质提取进行四因素三水平的优化分析。确立最佳提取条件：NaOH浓度0.001mol/L，提取温度45℃，提取时间40 min，料液比1∶25（g/mL），在此条件下蛋白质的提取理论值达到9.75mg/g。

响应面法；碱溶酸沉；葡萄籽蛋白质

葡萄是世界普遍栽培的水果之一，大部分的葡萄用于酿酒，近几十年来我国的葡萄酒行业发展迅猛，在葡萄酒的加工过程中，有约20%～30%的葡萄皮渣、籽等下脚料，大部分酒厂会直接扔掉或廉价卖给农民做饲料及燃料。这样做不仅造成了环境污染，而且也是资源的浪费。而从中提取出有效物质并进行加工利用，既可以降低生产成本，又可以提高资源的利用率［1-2］。随着对葡萄皮籽中化学成分的深入研究，发现葡萄皮籽中有丰富的营养物质，如油脂、蛋白、原花青素等。

目前，对葡萄籽的开发利用引起的国内外广泛的关注，主要集中在葡萄籽油、抗氧化物质的提取与利用，而对葡萄籽蛋白的提取利用较少。葡萄籽制油后的饼粕中含有13%～16%的蛋白质，采用脱壳制油工艺饼粕蛋白质含量高达30.39%，且葡萄籽蛋白含有18种氨基酸，人体必需的8种氨基酸俱全，其中缬氨酸、精氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸含量都相当于大豆蛋白中的含量，由于其含有丰富的多种氨基酸、维生素及矿物质等，具有保健、美容之功效［2］。为合理利用这一资源，我们对新疆石河子本地的葡萄品种赤霞珠葡萄籽蛋白质的提取进行了研究。

1　材料与方法

1.1主要材料和仪器

赤霞珠葡萄籽：新疆石河子市；牛血清蛋白、考马斯亮蓝G-250、石油醚、氢氧化钠、95%乙醇、磷酸等：均为国产分析纯。

FW80型粉碎机：温岭市百乐粉碎设备厂；BS224S型分析天平：北京赛多利斯仪器系统有限公司；GRX20型干热消毒箱：上海精宏实验设备有限公司；SH21-1型磁力搅拌器：上海梅颖浦仪器仪表制造有限公司；其他为实验室常规仪器。

1.2方法

1.2.1蛋白质标准曲线的绘制

取6支试管（编号1、2、3、4、5、6）分别加入100μg/mL牛血清蛋白（BSA）0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL。各管用蒸馏水补齐至1.0 mL。各加考马斯亮蓝工作液5 mL。混合均匀后于分光光度计595 nm处测吸光值，1 h内测完。以BSA浓度为横坐标，吸光值为纵坐标绘制标准曲线。

1.2.2赤霞珠葡萄籽蛋白质等电点测定

将碱溶上清液的pH分别调到3.50、3.68、3.80、3.90、4.00、4.10、4.20、4.40、4.60、5.00，静置30 min后离心，测定上清液蛋白质含量，含量最少的即为葡萄籽蛋白质的等电点。

1.2.3赤霞珠葡萄籽的预处理

将葡萄籽通过粉碎机粉碎，过40目筛。称取40 g葡萄籽粉于250 mL烧杯中，按1∶5（g/mL）的料液比加入石油醚放在磁力搅拌器上搅拌6 h后，静置5 min～6 min使固液分离，倒出上清液回收利用。然后向固相中按1∶10（g/mL）的料液比重新倒入石油醚，磁力搅拌6 h，倒出上清液回收利用，固相葡萄籽粉用蒸馏水清洗后晒干收集备用。

1.2.4葡萄籽蛋白质提取工艺流程

葡萄籽→预处理→碱溶酸沉［3］→离心（4 000 r/min，15 min）取上清液→加酸调节等电点→离心取沉淀→冷冻干燥→葡萄籽蛋白质

1.2.5单因素试验

选择影响蛋白质得率的因素：浸提温度（30、35、40、45、50℃）、浸提时间（20、30、40、50、60 min）、NaOH浓度（1×10-5、5×10-5、10×10-5、50×10-5、100×10-5mol/L）、料液比［1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25（g/mL）］进行单因素试验，分别考察各个单因素对葡萄籽蛋白质提取的影响。

1.2.6响应面优化试验

在单因素的基础上，选取对葡萄籽蛋白质提取效果影响较大的4个因素，采用响应面分析软件Design-Expert.8.05建立四因素三水平的Central Composite模型，通过试验确立最佳提取工艺参数。变量因素编码表及水平见表1。

1.2.7数据分析

试验一式三份进行，数据值为平均值±标准偏差（SD）。数据分析采用Origin 8.0以及Design-Expert. 8.05软件。

表1　响应面自变量因素编码及水平Table 1　Factors and levels in response surface test

2　结果与讨论

2.1蛋白质含量测定的标准曲线

蛋白质含量标准曲线见图1。

图1　蛋白质含量标准曲线Fig.1　The standard curve of protein content

如图1所示，蛋白质含量的标准曲线为y=0.00748x+ 0.008 05，R2=0.998 5。

2.2赤霞珠葡萄籽蛋白质等电点的测定

赤霞珠葡萄籽蛋白质的等电点测试见图2。

图2　蛋白质等电点的测定Fig.2　The determination standard of isoelectric point on protein

蛋白质在等电点沉淀的最多，上清液中蛋白质残留越少说明沉降的蛋白质的量越多［4］，由图2可知，赤霞珠蛋白质的等电点为pH 3.8。

2.3单因素试验结果

2.3.1提取温度对提取量的影响

在提取时间30 min、料液比1∶10（g/mL）、NaOH浓度0.01 mol/L、不同温度的条件下，赤霞珠葡萄籽蛋白质的提取量如图3所示。

图3　温度对蛋白质提取的影响Fig.3　Influence of temperature on protein extraction

由图3可知，最佳提取温度为45℃，之后随着温度的升高葡萄籽蛋白质提取量下降，可能是温度过高导致蛋白质变性，溶解度降低。

2.3.2提取时间对提取量的影响

在提取温度45℃、料液比1∶10（g/mL）、NaOH浓度0.01 mol/L、不同时间的条件下，葡萄籽蛋白质的提取量如图4所示。

图4　提取时间对蛋白质提取的影响Fig.4　Influence of time on protein extraction

由图4可知，随着浸提时间的延长蛋白质的提取量也随之增长，在40 min之后增加较为缓慢，考虑到能耗等问题，最佳提取时间选取40 min为宜。

2.3.3NaOH浓度对提取量的影响

在提取温度45℃、料液比1∶10（g/mL）、提取时间40 min、不同NaOH浓度的条件下，葡萄籽蛋白质的提取量如图5所示。

由图5可知，随着NaOH浓度的升高，蛋白质的提取率也逐渐升高，但浓度过高会导致蛋白质变性，导致提取量变低［5］，综合考虑选取NaOH浓度为50× 10-5mol/L为宜。

2.3.4液料比对提取率的影响

在提取温度45℃、NaOH 50×10-5mol/L、提取时间40 min、不同液料比的条件下，葡萄籽蛋白质的提取量如图6所示。

图5NaOH浓度对蛋白质提取的影响Fig.5　Influence of the concentration of NaOH on protein extraction

图6　液料比对蛋白质提取的影响Fig.6　Influence of liquid to solid ratio on protein extraction

由图6可知，随着液料比的增加，蛋白质溶解的量也增大，所以赤霞珠葡萄籽蛋白质的提取量也增加，但是在液料比在1∶20（g/mL）之后，蛋白质的提取量增加缓慢，综合考虑，选取料液比1∶20（g/mL）为宜。

2.4响应面优化分析

赤霞珠葡萄籽蛋白质提取的响应面试验设计及结果见表2，蛋白质提取量回归模型方差分析见表3。

表2　响应面试验设计及结果Table 2　Test design and results of response surface

续表2　响应面试验设计及结果Continue table 2　Test design and results of response surface

表3　蛋白质提取量回归模型方差分析Table 3　Analysis of variance to the extraction volume of protein

根据表2响应面分析法试验结果，对试验数据进行多元回归拟合分析［6］，得到葡萄籽蛋白提取量与各因素变量的二次方程模型：蛋白质的提取量=3.89-0.14×A+0.49C+4.21×D-0.30×A×B-0.35×A×B+0.44×C× D-0.23×A2-0.22×B2+0.66×D2

由表3中的回归模型的方差分析可知，模型的P＜0.000 1，失拟项的P=0.079 3＞0.05，不显著，表明建立的该模型可以用来分析和预测葡萄籽蛋白提取的工艺参数。同时由表3中的回归模型显著性分析可知，A、C、D、AB、AC、CD、A2、B2、D2对葡萄籽蛋白提取率的影响显著，B对葡萄籽蛋白得率的影响不显著。

温度与时间、温度与NaOH浓度、NaOH浓度与料液比互作用的等高线和响应面图分别见图7、图8、图9。

图7　温度与时间互作用等高线和响应面图Fig.7　Response surface and contour plots of temperature and time

图8　温度与NaOH浓度互作用等高线和响应面图Fig.8　Response surface and contour plots of temperature and NaOH concentration

图9　NaOH浓度与料液比互作用等高线和响应面图Fig.9　Response surface and contour plots of NaOH concentration and liquid to solid ratio

由图7可得，等高线图呈椭圆形，说明温度与时间之间的交互作用显著，由温度与时间的3D图可看出，葡萄籽蛋白提取率随温度变化的坡度较陡，彼此之间的交互作用较显著［7］，与回归模型的方差分析结果相符。

由图8可得，温度和NaOH浓度的等高线图呈椭圆形，说明两者之间的交互作用较显著，并且由温度和NaOH的3D图可知，葡萄籽蛋白提取率随温度变化的坡度较陡，温度对其影响较大，两者之间的交互作用较显著［8］，与回归模型的方差分析结果相符。

由图9可得，等高线图直线圆形，说明NaOH浓度和液料比之间的交互作用不显著，由NaOH浓度和液料比的3D图可看出，葡萄籽蛋白提取率随液料比变化的坡度较陡，彼此之间的交互作用较不显著。

2.5响应面结果分析及验证试验

由模型方程计算可得，葡萄籽蛋白提取率的最优试验方案为温度45.17℃、时间49.57min、料液比1∶ 25（g/mL），在此条件下的蛋白提取率的理论值达到9.78 mg/g。根据试验的实际情况将试验条件调整为温度45℃、时间40 min、料液比1∶25（g/mL），重复试验3次，最终得到的葡萄籽蛋白提取率的平均值为9.75 mg/g，与理论值基本一致。结果表明，该模型可以较好地反映出葡萄籽蛋白提取的条件，从而也证明了响应曲面法优化提取葡萄籽蛋白条件参数的可行性。

3　结论

在本文中，通过响应面法全面且直观地分析了各因素对葡萄籽蛋白提取率的影响，以及各因素之间对提取过程的交互影响，建立了二次多项式数学模型，经验证该模型合理可靠，表明影响浸提效果的主要因素是温度与料液比。赤霞珠葡萄籽蛋白质最佳提取条件为：浸提温度45℃，料液比1∶25（g/mL），浸提时间40 min，NaOH浓度0.001 mol/L，经过验证试验，葡萄籽蛋白的提取量为9.75 mg/g，工艺参数可供生产应用参考。

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Optimizing Extraction Technology of Protein from Grape Seed with Respones Surface Methodology

WU Fang，LI Kai-xiong，LI Ying-biao，CHEN Shuai，XU Cheng-jian*
（College of Food Sciences，Shihezi University，Shihezi 832000，Xinjiang，China）

Alkali-solution and acid-isolation method was used to extract protein from Cabernet Sauvignon grape seed to improve the utilization rate of grape seed，in which respones surface analysis was used to optimize extraction conditions.Based on the single factor experiments，the Central Composite design principles and Design-Expert.8.05 data ananlysis software were used to select four parameters of response surface design to optimize extraction process.The result showed the optimize extraction conditions：the concentration of NaOH 0.001 mol/L，extraction temperature 45℃，extraction time 40 min，liquid to solid ratio 1∶25（g/mL），the extraction value was 9.75 mg/g.

respones surface methodology；alkali-solution and acid-isolation；grape seed protein

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.10.025

吴芳（1982—），女（汉），硕士研究生，研究方向：食品加工与安全。
*

许程剑（1978—），男，副教授，工学博士，天然产物制备与功能活性研究。

2015-04-20