分子标记辅助选择聚合水稻抗虫抗病基因育种研究进展

李玉营，李声春，李晓方，2

（1.长江大学农学院，湖北 荆州 434025；2.广州南国农业有限公司，广东 广州 510800）

分子标记辅助选择聚合水稻抗虫抗病基因育种研究进展

李玉营1，李声春1，李晓方1，2

（1.长江大学农学院，湖北 荆州 434025；2.广州南国农业有限公司，广东 广州 510800）

褐飞虱、白叶枯病和稻瘟病是水稻生产中的主要病虫害，一旦发生会造成水稻大幅度减产。分子标记辅助选择相对于传统育种，可大大缩短育种年限，提高育种效率。将多个抗性基因聚合到同一材料中，可提高水稻对病虫害的综合抗性。总结了水稻主要抗病虫基因的研究和利用现状，综述了分子标记辅助选择在水稻抗病虫育种方面的应用、研究进展及目前所面临的困难。

褐飞虱；白叶枯病；稻瘟病；分子标记辅助选择；基因聚合

李玉营，李声春，李晓方，等.分子标记辅助选择聚合水稻抗虫抗病基因育种研究进展［J］.广东农业科学，2016，43（6）：119-126.

水稻是世界主要粮食作物之一，也是我国第一大粮食作物，中国有65%的人以大米为主食［1-2］。然而褐飞虱、白叶枯病和稻瘟病是水稻的主要病虫害，每年都会造成大量的产量损失［3］，是农民种植面临的主要问题。目前针对水稻病虫害的防治主要是化学手段，化学防治可以很大程度减轻病虫害的危害，但会增加成本且污染环境，长时间的使用化学物质也会导致新的变异小种的产生，给病虫害的防治带来更大的挑战。生产实践表明，培育并种植水稻抗性品种是控制病虫害最经济、环保和有效的方法［4］。传统育种是通过表现型对基因型进行间接选择，这种选择方法的结果易受微效多基因、遗传背景、环境和发育时期等因素的影响［5］，因此选择效率较低，且年限较长。分子标记辅助选择（marker-assisted selection，MAS）是通过与目的基因紧密连锁或共分离的分子标记，对目的基因进行筛选，因而不受环境条件的影响，增加了选择的可靠性［6］。利用分子标记辅助选择将抗性基因转入遗传背景较好的水稻材料中，可明显改良该材料对病虫害的抗性。聚合不同类型的多个抗病虫基因到同一材料中，可以提高材料的抗病等级、拓宽抗谱，是水稻抗病虫品种培育的发展方向。将多个抗性基因聚合到同一品种中，其抗谱增加并不是单个基因的抗谱之间的简单累加，而是基因之间表现为极显著互作［5］。而且众多研究表明，聚合多个抗性基因能明显提高品种的抗性水平和持久性［7］。本文主要综述了水稻褐飞虱、白叶枯病和稻瘟病基因的发掘现状，及目前分子标记辅助选择聚合水稻抗性基因的研究进展。

1 褐飞虱研究进展

褐飞虱（Nilaparvata lugens）属同翅目飞虱科昆虫，仅取食稻，是我国及亚洲稻区重要虫害之一［8-9］。褐飞虱是典型的吸食维管束液的昆虫［10］，它不仅会影响水稻中营养物质的运输，而且还存在传播草状矮缩病（grassy stunt virus）、高低矮缩病（rugged stunt virus），以及通过产卵器划破穗颈产卵等危害［11-12］，造成植株生长缓慢，产量下降。严重时引起飞虱“火烧”，稻田成片枯萎，造成严重减产甚至绝收［13］。褐飞虱对亚洲稻区影响很大，在栽培抗稻褐飞虱品种面积较大的地区，一旦产生变异，对水稻生产将构成严重威胁［14］。因此研究褐飞虱抗性基因及其抗性育种意义重大。

1.1 褐飞虱基因的研究现状

目前，已发现和报道的水稻抗褐飞虱基因达到28个，已有24个主效抗性基因被定位［15-16］，仅有Bph14被成功克隆［17］，此外还鉴定了一些重要的抗性QTLs，各基因所在染色体见表1［16，18-20］。 bph5、bph7、bph8、bph24（t） 4个基因尚未定位。其中Bph3和bph4抗谱较广，可抗生物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型；bph8、Bph9、Bph10、Bph12 （t）、Bph14、Bph15抗生物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型。

表1 水稻抗褐飞虱基因在染色体上分布情况

Bph14是水稻中第一个被克隆的抗虫基因，它在水稻苗期和成熟期都表现抗性，在根、叶片和叶鞘的维管束即褐飞虱的摄食部位表达，降低了褐飞虱的取食、生长速率和寿命［16-17］。梁云涛等利用携有Bph18（t）基因抗褐飞虱材料与感虫材料之间在抗虫位点上的单核苷酸差异分析，成功开发出1个STS标记KC1，并通过研究得出结论KC1标记对目的基因有较高的选择效率，可以应用于扬稻6号遗传背景下Bph18（t）基因的分子标记辅助选择［21］。Yongfu Qiu等利用9311和籼稻B14的F2群体，将bph12基因定位到水稻第4染色体RM16459-RM1305间1.9cM的范围内，并构建了一个包含bph12座位的以日本晴（感BPH）为背景的近等基因系，通过与携带Bph6的NIL杂交，建立了携带有两个基因的聚合株系，并证明了不同BPH抗性基因的聚合产生了更强的对BPH虫的拒趋作用和抗生作用［18］。 Huang等利用高分辨率的遗传连锁分析，对Bph27进行定位，最终将其定位在日本晴基因组一个86.3kb的区间内［22］。Yasumori Tamura等对Bph26进行图位克隆，发现Bph26和Bph2是同一个基因，Bph2对其中一种亚洲褐飞虱抗性较差，但与其它抗性基因聚合可获得更为持久广泛的抗性［20］。

1.2 分子标记辅助选择技术在水稻抗褐飞虱育种中的应用

随着分子标记辅助选择技术的发展，水稻聚合育种也取得很大进步，不少育种家和研究者运用此技术将褐飞虱抗性基因转到其他品种中或聚合多个抗性基因，大大提高了品种的抗性。李进波等以抗褐飞虱材料B5和优良杂交稻9311及1826为亲本，通过复交和回交，运用MAS技术对Bph14 和Bph15进行鉴定选择，最终得到一系列目标基因纯合且农艺性状优良的稳定株系，并证明利用与Bph14 和Bph15 紧密连锁的分子标记开展抗褐飞虱分子标记辅助选择育种是一种有效的育种途径［13］。刘开雨等将抗稻褐飞虱基因Bph3和Bph24 （t）分别导入主栽杂交水稻恢复系广恢998、9311、R15、明恢63、R29中，获得多份含抗性基因的材料，其中Bph24（t）导入系对稻褐飞虱抗性略强于Bph3导入系；Bph3、Bph24（t）聚合系的抗性最强，因此抗性基因聚合对稻褐飞虱的抗性具有基因累加效应［23］。Jie Hu等将Bph14和Bph15转到明恢63中，分别得到了含有单抗性基因和双抗性基因的材料，均较大提高了水稻对褐飞虱的抗性，其中双抗性基因的材料与单抗性基因材料相比，表现出更强的抗性［24］。Jie Hu等将Bph14、Bph15和Bph18导入9311及其杂交种中，结合表型鉴定，得出基因的抗性效应大小顺序为14/15/1 8 ≥ 14/15 ＞ 15/18 ≥ 15 ＞ 14/18 ≥ 14 ≥ 18 ＞无抗性基因材料，而且田间数据表明，导入抗性基因材料的产量与对照相当甚至更高［25］。胡巍等利用MAS和回交育种，将Bph3、Bhp14和Bph15分别导入到华南高产水稻品种桂农占中，获得了多个含抗性基因的稳定株系，且各株系的农艺性状和产量性状与桂农占均没有显著差异［26］。

表2 水稻抗白叶枯病基因在染色体上分布情况

2 白叶枯病研究进展

水稻白叶枯病是由黄单胞杆菌水稻致病变种（Xanthomonas oryzae pv.oryzae，Xoo）引起的，是水稻最严重的细菌性病害之一，水稻感染白叶枯病以后一般减产20%～30%，严重的可减产50%，甚至颗粒无收，目前已成为一种全球性的水稻病害［5，27-28］。早稻秧苗感染白叶枯病病菌后往往不表现症状，成为带菌苗，晚稻在三四叶期就可表现症状。白叶枯病的传播主要是靠植株伤口、水孔和叶鞘及叶鞘基部的变态气孔。

2.1 白叶枯病基因的研究现状

目前，经国际注册确认和期刊报道的水稻白叶枯病抗性基因共38个，其中26个为显性基因，12个为隐性基因；已被定位的抗性基因有26个，其中Xa1［29］、xa5［30］、xa13［31］、Xa21［32］、Xa23［33］、Xa26［34］、Xa27［35］等7个基因已成功克隆，各基因在染色体上的分布见表2［36］。由表2可知，除12个未定位基因外，11号染色体上的抗白叶枯病基因最多，达10个；Xa7、xa8、Xa11、Xa12、xa15、Xa16、Xa17等17个基因属于成抗基因，其中显性基因11个，隐性基因6个。Xa21是第一个从野生稻中被克隆出来的重要功能基因，在分蘖后期表达抗性，因其广谱的抗性而受到广泛关注，Xa21 编码产物是一个由1 025个氨基酸组成的类受体蛋白激酶，主要有几个典型的结构域，即LRR 区、跨膜区、激酶区等［37］，Xa21在刚发现时具有较广的抗谱，但随着它在抗病育种中的广泛应用，致使新的致病小种出现，例如携带Xa21的水稻材料IRBB21对广东的白叶枯病小种Ⅳ、Ⅴ型均表现不抗［38］。Xa21虽然已研究较为深入，但仍有一些问题待解决，如Xa21对Xoo抗性的具体调控网络，Xa21是否还存在其他的结合蛋白靶标等［28］。Xa23是另一个被认为抗白叶枯病较好的基因，它是迄今已知基因中抗谱最广、抗性导入效应很强的一个完全显性的全生育期抗性基因［39］。Xa23 于1998年由章琦等鉴定，2011年经国际水稻新基因命名委员会正式命名为Xa23，不少学者也对其进行了深入的研究，2003年潘海军等利用SSR标记和RAPD标记，将Xa23 定位于水稻第11染色体长臂上SSR标记RM206和RAPD标记RpdH5之间，遗传距离分别为1.9cM和7.0cM［40］；2005年王春连等利用EST标记，将Xa23定位在第11染色体上C189和CP02662之间，遗传距离分别为0.8cM和1.3cM，并将C189成功用于水稻分子育种实践，标记辅助选择的正确率接近100%［41］；2014年Chunlian Wang等对Xa23做了精细遗传图谱，并开发了6个与Xa23位点共分离或紧密连锁的新的STS标记Lj36、Lj46、Lj138、Lj74、A83B4和Lj13，最终将Xa23基因定位于标记Lj138和A83B4之间0.4cM的区域内，并鉴定该基因在该区域与标记Lj74共分离，LOC_Os11g37620是Xa23基因最有可能的候选基因，这些结果均有利于在水稻育种中对Xa23进行分子标记辅助选择，也有利于一些有价值的抗性基因的分子克隆［42］。

2.2 分子标记辅助选择技术在水稻抗白叶枯病育种中的应用

近几年人们对白叶枯病的研究较多，不仅培育出许多携带单抗基因的品种，也培育出了很多含有多个抗性基因的新品种。Zhang等运用MAS技术将Xa7和Xa21聚合到明恢63中，大大提高了明恢63及其杂交种对白叶枯病的抗性［43］。曹立勇等利用分子标记辅助选择技术培育出国稻6号，通过了国家和重庆市审定，并大面积推广［44］；郑家团等利用常规杂交育种技术和MAS技术，快速获得了12份具有Xa23基因的稳定恢复系材料，采用白叶枯病菌株的专化强毒菌系P6对所得材料进行室内接种鉴定，筛选出1份高抗白叶枯病的抗性新恢复系材料［45］。Yanchang Luo等将Xa4、Xa21和Xa27基因导入绵恢725或9311为背景的恢复系，并通过2个株系的杂交将3个抗性基因叠加，最终构建一个带有Xa4、Xa21和Xa27的新恢复系（XH2431）［46］。闫成业等将白叶枯病抗性基因Xa7、Xa21和螟虫抗性基因cry1C*聚合到水稻恢复系先恢207中，育成了2个携带Xa7+Xa21+cry1C*基因的改良恢复系株系，并且农艺性状和产量表现均较好［47］；Jung-Pil Suh等将Xa4、xa5、Xa21聚合到同一水稻材料中，结果表明含有3个抗性基因的材料对水稻白叶枯病的抗性明显强于仅含有1个或2个抗性基因的材料，而且这些抗性基因对水稻的农艺性状没有不良影响［48］。杨德卫等利用MAS技术将Xa23导入优良早稻恢复系中，通过田间鉴定筛选出7份抗白叶枯病的优良恢复系材料［49］。

3 稻瘟病研究进展

稻瘟病在水稻整个生育期内都可能发生，因此根据发病时期和发病部位，可分为苗瘟、叶瘟、穗瘟、节瘟和谷粒瘟［50］，而其中尤以穗颈瘟对产量影响最为严重。稻瘟病是一种世界性稻作病害，全球每年因稻瘟病造成的水稻产量损失达11%～30%，严重的可达 50%以上，局部田块甚至颗粒无收，中国稻瘟病的年发生面积均在380万hm2以上，每年因稻瘟病危害损失稻谷 2亿～10 亿kg［51-52］。稻瘟病分布范围广，造成的危害大，是目前水稻生产中亟需解决的问题之一［53］。实践证明，培育与种植抗病品种是最经济有效的防治稻瘟病措施。然而，大多抗病品种推广数年后抗性会逐步丧失，其主要原因是大面积种植的品种往往抗病基因相对单一，使得稻瘟病菌群体中的毒性小种逐渐成为优势小种，造成病害流行。因此选育持久抗病品种是育种工作者一贯追求的目标［52］。

3.1 稻瘟病基因的研究现状

目前，至少有69个抗稻瘟病位点共84个主效基因已被定位，这些基因成簇地分布于除第3 染色体外的所有水稻染色体上，各基因所在染色体情况见表3，其中有pi21和pi55（t）为隐性基因，其他为显性基因，已有Pb1、Pi-a、Pi-b、Pi-d2、Pi-d3、Pi-k、Pik-h/Pi54、Pik-m、Pik-p、Pi-sh、Pi-t、Pi-ta、Piz-t、Pi1、Pi2、Pi5、Pi9、pi21、Pi25、Pi36、Pi37、Pi56（t）、Pi63、Pi-CO39等24个基因被成功克隆［54］。由表3可知，大部分基因分布在第6、11和12号染色体上，出现了较多基因等位、复等位的情况，如Pi-a和Pi-CO39等位，Pid3 与Pi25 等位，Pi-ta2 与Pi-ta 等位，Pi22（t）可能和Pi2等位，Pi26可能与Pi-z等位，Pi1、Pik-h/Pi54、Pik-m、Pik-p同为Pik位点上的复等位基因，Pi2、Pi9、Pi50、Pigm、Piz、Piz-t同为Piz 位点上的复等位基因等；另外还有基因连锁的情况，如Pi-sh 和Pi-t连锁，Pi15和Pi5/Pi3/Pi-i紧密连锁或等位，Pi-19和Pi-ta2紧密连锁或等位等。

3.2 分子标记辅助选择技术在水稻抗稻瘟病育种中的应用

稻瘟病的抗性基因较多，生理小种也较多，分子标记辅助选择技术在水稻稻瘟病育种中也取得较多成果。Haichao Jiang等通过分子标记选择的方法将基因Pi1，Pi2，和D12 导入到金23B及其衍生的杂交稻中，结果表明金23B及其杂交水稻中所包含的抗性基因越多，则其对稻瘟病的抗性越强［55］；肖武名等通过回交、自交和分子标记辅助选择，将抗病基因Pi46（t）转育到强恢复系广恢998中，并在第四代自交群体中选出较好的单株R1198，结果表明R1198比广恢998的抗谱明显拓宽［56］；闫成业等采用杂交、回交和MAS技术将广谱抗性基因Pi9渗入到Q优6号的父母本中，得到的杂交后代在保持产量、生育期、稻米品质和主要农艺性状相似的基础上，明显提高稻瘟病抗性，降低生产风险［57］。涂诗航等将稻瘟病抗性基因Pi25导入保持系福稻B中，并通过多次回交检测，最终获得具有良好稻瘟病抗性和不育性的水稻材料［58］。张荟等以含Pi9的水稻材料为供体，与4个优良恢复系杂交、回交、复合杂交，并运用MAS技术培育了多个抗稻瘟病的水稻新恢复系［59］。杜太宗等运用MAS技术将抗稻瘟病基因Pi1、Pi9导入水稻保持系金23B中，大大提高了其稻瘟病抗性水平，且双抗性基因材料的抗性提高更加显著［60］。

表3 水稻抗稻瘟病基因在染色体上的分布情况

4 分子标记辅助选择在水稻多种病虫害抗性基因聚合上的应用

含有单一水稻抗病虫基因材料的抗性仍有局限性，长时间和大面积的推广易导致其抗性的降低或丧失，因此将针对多种病虫害的多抗性基因聚合到同一材料中，不仅可以增强材料对水稻病虫害抗性的广谱性和持久性，减少化学药物施用量，降低对环境的影响，而且可以提高水稻产量，改善品质。阳海宁等将基因Xa23和Bph3分别导入主栽杂交水稻品种的保持系中，获得双抗性基因聚合系144份，接种结果表明，具有单一抗性基因的株系与同时含有两个目的基因的抗性水平相当而且农艺性状与受体材料相比差异不显著［61］；胡杰等利用分子标记辅助选择将水稻抗褐飞虱基因Bph14、Bph15和抗稻瘟病基因Pi1、Pi2同时导入珍汕97B中，使其同时获得褐飞虱和稻瘟病抗性，田间鉴定结果表明，改良杂交稻的褐飞虱和稻瘟病抗性均显著提高［62］；毛钟警等利用MAS技术将水稻抗白叶枯病基因Xa23和抗褐飞虱基因bph20（t）聚合到同一材料中，并获得纯合株系，培育出具有抗白叶枯病和褐飞虱双抗基因的个体，为水稻育种提供抗性材料［63］；赵鹏等利用常规育种、MAS和抗病虫鉴定相结合的手段，将抗稻褐飞虱基因bph20（t）和bph21（t）及高抗稻瘟病基因Pi9聚合到优良保持系博ⅢB中，筛选获得5份聚合褐飞虱抗性基因（bph20和bph21）和抗稻瘟病基因Pi9的抗或高抗水稻中间材料，为选育新的双抗保持系和不育系提供了种质材料［64］；潘晓飚等利用MAS和田间鉴定选择相结合的方法，将三黄占2号的抗稻瘟病主基因Pi-GD-1（t）、Pi-GD-2（t）和主效QTL GLP8-6（t）及抗白叶枯病基因Xa23导入到明恢86、蜀恢527和浙恢7954等3个骨干中籼恢复系中，通过复交进行基因聚合，获得5个带有抗稻瘟病兼抗白叶枯病的双基因或多基因聚合系，结果表明，抗稻瘟病基因和抗白叶枯基因Xa23在不同恢复系背景下的抗性表达完全，对恢复系稻瘟病以及白叶枯病改良的效果明显［65］；田大刚等将Pi9和Xa23导入到3个新育成的水稻恢复系中，明显提高了改良恢复系对稻瘟病和白叶枯的抗性，且农艺性状与原材料无明显差异［66］；楼珏等（2016）将抗稻瘟病基因Pi-GD-1（t）、Pi-GD-2（t），抗白叶枯病基因Xa23和抗褐飞虱基因Bph18（t）导入3个中籼恢复系中，获得了8个多抗性基因聚合系，大大改良了原恢复系的综合抗性［67］。

5 分子标记辅助选择聚合水稻抗虫抗病基因育种的展望

目前发现的水稻病虫抗性基因的抗谱相对狭窄，因此抗谱较广、抗性较强的资源有待于进一步挖掘；然而抗性较好的新型资源一般在野生材料中发现，这些材料常常会含有较多的不利基因，有些甚至与目标抗性基因连锁，通过常规的方法很难打破连锁，在利用这些资源时会对原来的优良材料产生影响，而通过连续回交有可能导致目标抗性基因的丢失［14］，因此有些较好的抗性基因在育种中利用率较低。在现有发掘的抗性基因里，有些尚未精确定位，选择时效率较低，但随着越来越多的水稻SSR标记被开发，将有助于解决因分子标记与目标基因较远而造成基因型与表型不一致的问题［68］，使选择的结果更加准确。

当前水稻分子标记辅助选择育种主要集中在少数主效基因的利用上，而大部分基因并未得到应用，而且在数量性状方面的应用也相对较少。研究发现稻瘟病的抗性是由多基因控制的数量性状，而对于数量性状的定位目前还有很大难度，现有的分子标记选择技术对多位点多基因的选择相对困难［50］。受主效基因控制的含有单一抗性基因的品种在大面积推广之后，由于致病菌和害虫的变异，很快会使原有的抗性降低甚至丧失，且易导致新的生理小种的产生，因此抗性主效基因与微效多基因结合，以及多个主效基因聚合育种将成为水稻分子育种的主要方向；将多个抗性基因聚合到同一材料中不仅可以提高其抗性的广谱性和持久性，而且有可能降低因新的生理小种的产生而带来的损失，但是在聚合同一抗性或不同抗性多个基因时，并不一定越多越好，随着聚合基因数目的增加，不良性状的连锁累赘也可能增加［69］，聚合材料的农艺性状、产量性状是否受到影响，以及抗性水平是否显著提高，仍需要通过表型进行验证。

分子标记辅助选择为水稻抗病虫育种提供了一个简便的途径，相对于表型鉴定，从分子水平确定材料中是否含有所需的目的基因，既准确又可靠，有利于缩短育种年限，通过分子选择与表型鉴定相结合，减轻了育种工作量，同时也增加了结果的可信性，因此分子标记辅助选择技术将在水稻育种中得到广泛的发展与应用。但MAS在水稻育种上仍有一定的局限度，一方面一些MAS育种的技术参数仍知之较少，如每个世代中应检测和保留的个体数，以及是采用单个标记还是双个标记基因等问题［70］；另一方面，MAS育种需要对每个基因进行选择，如果聚合多个抗性基因，需要利用与每个抗性基因紧密连锁的分子标记对其进行选择，工作量会大大增加。因此在育种中需要优化分子设计，优先选择功能性标记，当选择标记距离目的基因较远时可采用双标记的方法提高选择效率，另外可尝试使用多重PCR技术或基因芯片技术，但成本也会相应增加［5］，所以仍需寻找一种简单、成本较低的方法来解决目前限制多基因聚合育种的问题。

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（责任编辑 杨贤智）

Research progress of molecular marker-assisted selection for pyramiding disease and insect resistance genes in rice

LI Yu-ying1，LI Sheng-chun1，LI Xiao-fang1，2
（1.College of Agriculture，Yangtze University，Jingzhou 434025，China；2.Guangzhou Nanguo Agriculture Ltd.，Guangzhou 510800，China）

The rice yield decreases greatly because of the brown planthopper，bacterial blight or blast occur，which are major pest and diseases in rice.The combination of marker-assisted selection with traditional breeding technology could enhance breeding efficiency.The resistance against diseases and insect pests of rice could be improved significantly when multiple resistance genes were pyramided to one material.The application，research progress and difficulties of molecular marker-assisted selection in rice breeding were introduced .

brown planthopper；bacterial blight；rice blast；marker-assisted selection（MAS）；gene pyramiding

S511.034

A

1004-874X（2016）06-0119-08

10.16768/j.issn.1004-874X.2016.06.021

2016-02-11

国家科技支撑计划项目（2014BAD 01B04）

李玉营（1993-），男，在读硕士生，E-mail：liyuying930421@163.com

李晓方（1962-），女，博士，教授，E-mail：lixiaofang35@126.com