五华三黄鸡MHC-B区域复合微卫星位点LEI0258遗传多样性与进化研究

黄勋和，张金枫，谭坤凤，李丽芝，李威娜，钟福生

（嘉应学院生命科学学院，广东 梅州 514015）

五华三黄鸡MHC-B区域复合微卫星位点LEI0258遗传多样性与进化研究

黄勋和，张金枫，谭坤凤，李丽芝，李威娜，钟福生

（嘉应学院生命科学学院，广东 梅州 514015）

应用MHC-B区域复合微卫星位点LEI0258研究五华三黄鸡的遗传多样性与进化地位。147份样品共检测到48个等位基因，长度范围为181～495 bp。等位基因251（0.0952）、275（0.0850）和310 （0.0816）频率最高。DNA测序鉴定出44个等位基因，其中42个为首次发现。观察杂合度、期望杂合度和多态信息含量分别为0.830、0.927和0.952。9个等位基因与15种已知MHC血清型相匹配。基于侧翼区变异信息的中介网络图将44个等位基因分为7个进化枝，其中3个进化枝存在于红原鸡中，提示五华三黄鸡起源于红原鸡。研究结果表明，微卫星LEI0258适用于鸡群体遗传多样性、血清型鉴定和进化研究。

多态性；主要组织相容性复合体；LEI0258；五华三黄鸡；进化；血清学

黄勋和，张金枫，谭坤凤，等.五华三黄鸡MHC-B区域复合微卫星位点LEI0258遗传多样性与进化研究［J］.广东农业科学，2016，43（6）：163-168.

主要组织相容性复合体（Major histocompatibility complex，MHC）是基因组编码细胞免疫相关蛋白的基因。鸡MHC位于16号染色体上，由两个独立的 B区和Y区组成［1］。B区对宿主许多传染性疾病（如马可氏病）的抗性或易感性等有关［2］。传统采用血清学的方法对MHC进行分型，但由于不同群体的血清型存在较大差异，该技术难以广泛推广［3-4］。而位于B区的微卫星位点LEI0258被认为与血清型显著关联后［5-6］，涌现出一系列基于LEI0258多态性、进化与免疫的研究，丰富了LEI0258的基础理论，加强了对生产实践的指导作用［7-12］。

五华三黄鸡是原产于广东省梅州市五华县的优良小型肉用地方品种［13］。由于外来品种的大量引进和自身生长速度慢、繁殖性能较低等缺点，目前五华三黄鸡只少量分布于五华县的边远山区。为了科学保护和合理利用五华三黄鸡，近年来开展了资源调查、品种特性、保种选育、遗传资源与进化等研究，取得了一定的成果［14-19］，但抗病相关的基础研究尚属空白。本研究利用微卫星位点LEI0258分析五华三黄鸡的遗传多样性，探讨LEI0258等位基因与MHC血清型的关系，进一步了解LEI0258的进化动态，为五华三黄鸡保种选育提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料共147份样品，来源于五华三黄鸡原产地五华县棉洋、安流、龙村、硝芳、周江、梅林和谭下7个乡镇偏远山区农户自孵自养的无明显亲缘关系的个体，采集时间为2012年10月至2013年11月，样品类型为背部带羽髓羽毛。基因组DNA采用试剂盒HiPure Tissue DNA Mini Kit （美基生物，广州）提取，-20℃保存备用。

1.2 PCR扩增与基因分型

微卫星位点LEI0258使用引物LEI0258F：5' -CACGCAGCAGAACTTGGTAAGG-3' 和LEI0258R：5' -AGCTGTGCTCAGTCCTCAGTGC-3' 扩增［6］。正向引物5' 端添加了荧光标记FAM。PCR反应体系为20 μL，含10×PCR buffer 2μL，dNTP mixture （2.5 mmol/L）1.6 μL，引物（20 μmol/L）各0.2μL，rTaq DNA聚合酶（Takara，大连）1 U，DNA模板50 ng。扩增条件为94℃预变性4 min；94℃变性30 s、63℃退火1 min、72℃延伸1 min，35个循环；72℃延伸10 min。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测后在ABI 3730分析仪上进行基因型判定，基因分型工作由无锡翼和应用生物技术有限公司完成。

1.3 微卫星测序

基于基因分型结果，每个等位基因挑选1个以上样品进行测序。具体挑选原则为：如果等位基因只为1个样品所有，只挑选该样品进行测序；如果等位基因为多个样品所共有，则挑选不同乡镇的样品进行测序。待测样品PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，割胶回收需要测序的片段，连接T载体（Takara，大连），然后转入大肠杆菌DH5α，在LB培养基中进行过夜培养，再使用LEI0258引物进行PCR鉴定，最后送广州艾基生物技术有限公司进行双向测序。

1.4 数据分析

等位基因数（NA）、观察杂合度（HO）、期望杂合度（HE）和多态信息含量（PIC）通过软件Cervus 3.0.3［20］计算。序列由软件BioEdit［21］编辑处理，并辅以人工校验。微卫星侧翼序列用于多态性分析，同时使用软件SplitsTree 4.10构建中介网络图（median-joining network）［22］。

2 结果与分析

2.1 LEI0258基因型多态性

147份样品共检测到48个等位基因，长度范围为181～495 bp。其中251频率最高（0.0952），其次是275（0.0850）、310（0.0816）和495 （0.0782），多个等位基因只出现1次（表1）。在样品量接近的情况下，不同等位基因在不同群体中出现的频率不尽相同，例如205和251在周江群体多于梅林群体，495在谭下群体多于其他群体。有些等位基因只出现在某个群体中，例如206、261 和334只分布于谭下群体中，217、336、372、407 和425仅分布于梅林群体中。

五华三黄鸡群体微卫星LEI0258遗传变异水平见表2。在五华三黄鸡7个群体中，HO均明显低于HE，说明可能存在空位点。但HE、HO和PIC均高于0.8，高于先前的微卫星研究［18］，表明五华三黄鸡保持着较高的遗传变异水平。

2.2 LEI0258核苷酸多态性

挑选 1 2 1个片段进行 D N A测序，获得44个等位基因，片段长度从182～489 bp不等，其中42个是首次发现（表3）。大部分测序鉴定的等位基因长度要小于基因分型的结果，只有等位基因182、193、194、205、206和217与测序结果一致（表 3）。LEI0258有两个重复单元R13（CTATGTCTTCTTT）和R12 （CTTTCCTTCTTT），重复次数分别为1～18和2～27，呈现此消彼长的关系。重复区上游有77 bp（包括引物序列），下游75 bp。上游发现6个变异位点，以转换为主，-29、-30出现“TT”缺失的现象。下游发现4个变异位点，以颠换为主。下游11～18“ATTTTGAG”的多态现象与Han等［9］和Chazara等［10］的报道相同，但与Fulton等［5］报道的“ATTTGAGG”不一致。9个等位基因（194、205、295、309、345、381、393、420、443）对应于15种血清型，分别是B1、B5、B6、B10、B13.1、B13.2、B14、B17、B24、B26、B34、B62、B76、BW3 和BW11（表3）。

表1 五华三黄鸡群体微卫星LEI0258等位基因频率

表2 五华三黄鸡群体微卫星LEI0258的遗传变异分析

表3 五华三黄鸡微卫星LEI0258位点等位基因多态性

2.3 LEI0258侧翼区中介网络图分析

去掉微卫星LEI0258重复区后，基于侧翼区的变异信息构建中介网络图（图1）。44个等位基因分为7个进化枝（A～G），每个进化枝含1～23个等位基因，B、C和F只有1个等位基因，D则有17个，而R13大于1的等位基因全部在进化枝D中。进化枝A、D和G同样存在于红原鸡中。

图1 基于五华三黄鸡LEI0258位点侧翼区变异信息的中介网络图

3 结论与讨论

本研究结果表明，五华三黄鸡微卫星位点LEI0258显示出极高的多态性，与该群体的遗传资源现状相符，说明LEI0258适用于评估鸡群体遗传多样性水平。同时LEI0258与MHC血清型显著关联，通过研究LEI0258单倍型，可快速鉴定血清型，降低研究成本和提高效率。

3.1 LEI0258多态性

本研究获得五华三黄鸡微卫星位点LEI0258等位基因44个，其中42个未在其他群体发现［5，8-10］。Han等［9］发现了21个LEI0258的新等位基因，等位基因489只存在于中国地方鸡群体中，稀有等位基因可作为鉴定鸡品种和监测鸡群体保护动态的依据。本研究发现的新等位基因可能是五华三黄鸡群体所特有的，可作为品种鉴定的潜在分子标记，但需要进一步确认。

五华三黄鸡LEI0258表现出极高的多态性（HO＞0.83，PIC＞0.95），高于许多地方鸡种如会宁鸡、静宁鸡、丝羽乌骨鸡和商品鸡［10，12］。五华三黄鸡其他微卫星研究同样表现出高多态性［18］，说明该品种仍保留着较高的遗传多样性，具有很大的保护潜力与利用价值，这得益于五华三黄鸡封闭的自然环境和饲养模式。因此，微卫星位点LEI0258可作为研究鸡群体遗传多样性的候选分子标记。

3.2 LEI0258与血清型

MHC血清型类型的丰富程度与疾病抵抗能力正相关［7，23-24］。由于可获得的血清型信息有限，并且五华三黄鸡新发现的等位基因较多，许多等位基因的血清型无法确定。9个等位基因与15种已知血清型相对应，这些血清型大部分来源于白来航鸡，并且已在其他鸡群体中得到验证［5，9，24］。剩余35个等位基因对应的血清型尚未鉴定，因此将来需要开展五华三黄鸡MHC血清型鉴定工作，从而为抗病研究提供理论依据。

3.3 LEI0258与进化

LEI0258是非典型性的微卫星位点，由两个重复单元R13和R12组成，两者不同的组合形成了不同的等位基因。同时侧翼区存在大量的插入缺失（indels）和碱基突变（SNPs），表现出极高的多态性［5，7-12］。目前NCBI数据库上LEI0258等位基因有80个，加上本研究新发现的42个，共122个，远高于其他微卫星位点。由于侧翼区的变异速率低于重复区，因而侧翼区的变异信息可作为划分等位基因的依据。然而，尽管会出现片段长度和重复单元相同而被划分为不同的等位基因的现象，但Chazara等［10］指出中介网络图更多反映的是等位基因之间的关系，而非系统发生关系。同时，E 等［11］鉴定出LEI0258在-30～43之间存在重组现象，可能在MHC的进化过程中发挥重要的作用。因为MHC处于与抗病能力密切相关编码区，无疑会受到选择的压力，因而LEI0258也可能处于选择和进化动态中［11］。

中介网络图将44个等位基因分为7个进化枝，重复单元R13大于1的等位基因全部分布在进化枝D中。进化枝A、D和G存在于红原鸡中，说明五华三黄鸡可能起源于红原鸡，与线粒体基因组的研究结论相一致［17］。

［1］Fillon V，Zoorob R，Yerle M，et al.Mapping of the genetically independent chicken major histocompatibility complexes B@ and RFP-Y@ to the same microchromosome by two-color fluorescent in situ hybridization［J］.Cytogenetic and Genome Research，1996，75（1）：7-9.

［2］Lee L F， Bacon L D，Yoshida S，et al.The efficacy of recombinant fowlpox vaccine protection against Marek's disease：its dependence on chicken line and B haplotype［J］.Avian Diseases，2004，48（1）：129-137.

［3］Fulton J E，Young E E，Bacon L D.Chicken MHC alloantiserum cross - reactivity analysis by hemagglutination and flow cytometry［J］.Immunogenetics，1995，43（5）：277-288.

［4］O'Neill A M，Livant E J，Ewald S J.The chicken BF1 （classical MHC class I）gene shows evidence of selection for diversity in expression and in promoter and signal peptide regions［J］.Immunogenetics，2009，61 （4）：289-302.

［5］Fulton J E，Juul-Madsen H R，Ashwell C M，et al.Molecular genotype identification of the Gallus gallus major histocompatibility complex［J］.Immunogenetics 2006，58：407-421.

［6］McConnell S K，Dawson D A，Wardle A，et al.The isolation and mapping of 19 tetranucleotide microsatellite markers in the chicken［J］.Animal Genetics，1999，30（3）：183-189.

［7］Chazara O，Juul-Madsen H R，Chang C S，et al.Correlation in chicken between the marker LEI0258 alleles and Major Histocompatibility Complex sequences［J］.BMC Proceedings，2011，5（S4）：S29.

［8］Chang C S，Chen C F，Berthouly-Salazar C，et al.A global analysis of molecular markers and phenotypic traits in local chicken breeds in Taiwan［J］.Animal Genetics，2012，43（2）：172-182.

［9］Han B，Lian L，Qu L，et al.Abundant polymorphisms at the microsatellite locus LEI0258 in indigenous chickens［J］.Poultry Science，2013，92（12）：3113-3119.

［10］Chazara O，Chang C S，Bruneau N，et al.Diversity and evolution of the highly polymorphic tandem repeat LEI0258 in the chicken MHC-B region［J］.Immunogenetics，2013，65（6）：447-459.

［11］E G X，Sha R N，Zeng S C，et al.Genetic variability，evidence of potential recombinational event and selection of LEI0258 in chicken［J］.Gene，2014，537 （1）：126-131.

［12］金丽娜，韩建林.鸡MHC区域内微卫星LEI0258和MCW0312的遗传多态性［J］.畜牧与兽医，2015，47 （7）：50-55.

［13］陈国宏，王克华，王金玉，等.中国禽类遗传资源［M］.上海：上海科学技术出版社，2004.

［14］李威娜，陈云燕，钟福生.广东省五华三黄鸡品种资源保护与利用现状及发展对策［J］.湛江师范学院学报，2011，32（6）：132-135.

［15］钟福生，李威娜，翁茁先，等.五华三黄鸡品种特性研究［J］.中国家禽，2012，34（9）：61-63.

［16］钟福生，李威娜，林伟鸿，等.五华三黄鸡生长发育规律及产肉性状分析［J］.湖南农业大学学报（自然科学版），2014，40（1）：56-59.

［17］黄勋和，陈洁波，李婷，等.基于线粒体全基因组的五华三黄鸡系统发育分析［J］.嘉应学院学报，2015，33（8）：70-75.

［18］黄勋和，李威娜，陈珊，等.五华三黄鸡群体遗传多样性与遗传结构分析［J］.中国家禽，2016，38（1）：56-58.

［19］Huang X H，Zhong F S，Li W N，et al.Complete mitochondrial genome of the Wuhua three-yellow chicken（Gallus gallus domesticus）［J］.Mitochondrial DNA，2016，27（2）：1311-1312.

［20］Kalinowski S T，Taper M L，Marshall T C.Revising how the computer program CERVUS accommodates genotyping error increases success in paternity assignment［J］.Molecular Ecology，2007，16（5）：1099-1106.

［21］Hall T A.BioEdit：a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT［J］.Nucleic Acids Symposium Series，1999，41（2）：95-98.

［22］Huson D H，Bryant D.Application of phylogenetic networks in evolutionary studies［J］.Molecular Biology and Evolution，2006，23（2）：254-267.

［23］Rogers S L， Kaufman J.High allelic polymorphism，moderate sequence diversity and diversifying selection for B-NK but not B-lec，the pair of lectin-like receptor genes in the chicken MHC［J］.Immunogenetics，2008， 60（8）：461-475.

［24］Wang H Z，Ma T，Chang G B，et al.Molecular genotype identification of different chickens：major histocompatibility complex［J］.Journal of Science and Technology，2014，2：1-7.

（责任编辑 崔建勋）

Diversity and evolution of the highly tandem repeat LEI0258 with in MHC-B region in Wuhua three-yellow chicken

HUANG Xun-he，ZHANG Jin-feng，TAN Kun-feng，LI Li-zhi，LI Wei-na，ZHONG Fu-sheng
（School of Life Sciences，Jiaying University，Meizhou 514015，China）

To investigate the polymorphism and evolution of Wuhua three-yellow chicken，the tandem repeat LEI0258 located within the B region of chicken major histocompatibility complex （MHC-B region） was applied.A total of 48 alleles ranging from 181 to 495 bp in 147 samples were found.Three alleles，251 （0.095），275 （0.0850），and 310 （0.0816） were the most frequency in this breed.Forty-two of 44 alleles defined by DNA sequencing was novel for Wuhua three-yellow chicken.The LEI0258 showed high levels of polymorphism，with 0.830，0.927 and 0.952 for observed heterozygosity，expected heterozygosity and polymorphic information content，respectively.Nine alleles were corresponding to 15 available serotypes.The 44 alleles were classified into seven clusters，based on the SNPs and indels found within the sequences flanking the repeats，of which three was also found in red fowl jungle，indicating that Wuhua three-yellow chicken was of origin from red fowl jungle.The results presented herein suggested that LEI0258 could be used as a candidate molecular marker for uncover genetic diversity，serology and evolution in chicken.

polymorphism；major histocompatibility complex；LEI0258；Wuhua three-yellow chicken；evolution；serology

S831.2；Q346+5

A

1004-874X（2016）06-0163-06

10.16768/j.issn.1004-874X.2016.06.028

2016-03-20

广东省自然科学基金（2014A03030 7018）；嘉应学院“创新强校工程”项目（CQX019）；广东省公益研究与能力建设项目（2015A020208020，2016A030303068）；嘉应学院重点科技计划项目（2015KJM03）

黄勋和（1982-），男，博士，讲师，E-mail：hxh826@126.com

钟福生（1958-），男，博士，教授，E-mail：zfs@jyu.edu.cn