青藤碱降低兔膝骨关节炎模型瘦素含量及其受体表达

郑洁 王瑞辉 杨威 寇久社

1. 陕西中医药大学针灸推拿学院，陕西 咸阳 712046 2. 陕西中医药大学中医系，陕西 咸阳 712046 3. 陕西中医药大学第二附属医院，陕西 咸阳 712046

骨关节炎(osteoarthritis，OA)是一种累及关节软骨、软骨下骨、滑膜和韧带等关节周围多种组织的退行性关节疾病，其具体发病机制至今仍不明确。脂肪因子是一类由白色脂肪组织分泌的内源性活性多肽，被认为与肥胖、胰岛素抵抗、糖尿病等多种代谢性疾病密切相关。近来发现，瘦素(leptin)、脂联素(adiponectin)、内脂素(visfatin)和抵抗素(resistin)等多种脂肪因子在炎性反应、软骨退变以及软骨下骨重塑等多个OA病理过程中发挥了重要作用[1-2]。青藤碱是从传统治疗风湿性疾病中药清风藤中提取的一种生物碱，具有镇痛、抗炎、调节免疫、降血压、抗心律失常等药理作用[3]。笔者前期实验研究发现，青藤碱关节腔注射可缓解兔膝关节骨性关节炎(knee osteoarthritis，KOA)滑膜炎性反应、降低关节液脂联素、内脂素和抵抗素水平，对软骨具有保护作用。本实验通过观察青藤碱关节腔注射对木瓜蛋白酶诱导的兔KOA模型血清及关节液瘦素水平以及软骨瘦素受体(Ob-Rb)mRNA和蛋白表达的影响，探讨青藤碱治疗KOA的部分作用机制。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1实验动物：新西兰大白兔40只，雌雄各半，体质量1.8～2.2 kg，由西安交大医学院实验动物中心提供，合格证号：SCXK(陕)2008-008。单笼、标准饲料喂养，室温20℃～25℃，相对湿度45%～60%，每天正常光照，空气流通，自由摄食、饮水。

1.1.2药物及试剂：正清风痛宁注射液(湖南正清制药集团股份有限公司，批号1304402-003，规格2 ml：50 mg)，玻璃酸钠注射液(山东博士伦福瑞达制药有限公司，批号130308011，规格2 ml：20 mg)，木瓜蛋白酶(Merck公司，货号107147，活力6000 USP-U/mg)。瘦素ELISA试剂盒(北京诺博莱科技有限公司)，Ob-Rb多克隆抗体(英国Abcam公司)，RNA提取试剂盒(北京全式金公司)，qPCR反应试剂盒(北京全式金公司)，Ob-Rb引物(南京金斯瑞生物科技有限公司)。

1.1.3仪器：Bio-Tec ELX808型酶标仪(美国Bio-Tec公司)，超薄切片机(德国LEICA公司)，5430R冷冻高速离心机(德国Eppendorf公司)，AB7500荧光定量PCR仪(美国ABI公司)，Thermo NanoDrop 2000C紫外分光光度计(美国Thermo公司)，湿式转移电泳槽(美国BioRad公司)，凝胶成像仪(美国BioRad公司)，硝酸纤维素膜(Bio-Rad公司)。

1.2 实验方法

1.2.1模型制备：采用木瓜蛋白酶关节腔注射法，分别于实验的第1、4、7天对造模组兔进行关节腔注射。(1)木瓜蛋白酶溶液配制：将木瓜蛋白酶按4%(20 mg/0.5 mL)的浓度溶解于生理盐水中，装入50 mL无菌瓶中并置于 0～4℃冰箱内保存备用。(2)兔关节腔注射方法：兔右膝关节备皮、75%乙醇消毒后，用左手从下方和两旁将右侧膝关节轻度屈曲位固定，右手持1 mL注射器在髌韧带附着点外上方约 0.5 cm 处向髁间窝方向进针，当出现落空感时表明已进入关节腔内，注入4%木瓜蛋白酶水溶液0.5 mL。

1.2.2分组及干预措施：40只兔先分为空白组(8只)和造模组(32只)，采用木瓜蛋白酶注射法于实验的第1、4、7天对造模组兔右膝关节腔注射0.5 mL的4%(20 mg)木瓜蛋白酶溶液。首次注射4周后随机处死2只造模兔，病理学观察出现典型软骨退变表现，同时兔右膝关节出现肿胀、跛行，表明造模成功。造模成功后，将造模组随机分为模型组(Model)、透明质酸钠组(HA)和青藤碱组(SIN)，每组10只。根据成人用药剂量(透明质酸钠和青藤碱均为2 ml/次)按Meeh-Rubner公式计算人兔等效剂量，具体注射剂量为0.2 mL/次。除空白组外，对各组动物造模侧膝关节行关节腔注射，青藤碱组膝关节腔注射盐酸青藤碱注射液0.2 mL(5 mg)，每3 天一次，10次一疗程，共给药10次；透明质酸钠组膝关节腔注射透明质酸钠注射液0.2 mL，每6天一次，5次一疗程，共5次；模型组膝关节腔注射生理盐水0.2 mL，注射次数同青藤碱组。干预时间共计30天。实验过程中对动物的处理方法符合中华人民共和国科学技术部颁发的《关于善待实验动物的指导性意见》。

1.2.3标本采集：(1)血清采集：干预结束后第2天，耳中动脉取血5 mL，4000 r/min离心10 min，分离血清后-80℃冰箱保存备检。(2)关节液采集：干预结束后第2天，生理盐水冲洗法收集关节液。于兔的右膝关节腔内注入生理盐水注射液1 mL(注射方法同前)，充分活动膝关节使生理盐水与关节液充分混合，再抽取关节腔生理盐水冲洗液0.6 mL～1 mL至EP管，4000 r/min离心10 min，取上清，-80℃保存备检。(3)软骨采集：用刀片仔细刮除取下股骨内、外侧髁表面的关节软骨，内侧髁软骨置入装有RNA保存液的EP管中后保存于-80℃冰箱，留待qPCR检测，外侧髁软骨置于EP管中后保存于-80℃冰箱，留待Western blot检测。

1.3 观察指标及检测方法

1.3.1血清及关节液瘦素含量检测(ELISA法)：采用ELISA法测定血清和关节液中瘦素含量，操作方法严格按照试剂盒说明书进行。

1.3.2Ob-Rb mRNA表达检测(qPCR法)：取股骨内侧髁软骨100 mg，采用RNA提取试剂盒提取总RNA，并用紫外分光光度计测定其纯度和浓度。用RNA逆转录试剂盒进行反转录，合成第一链cDNA。qPCR反应条件：50℃ 2 min和95℃ 10 min预变性；95℃ 15 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，共40个循环(收集荧光信号)。所有PCR均做3个复孔，重复3次，结果以2-ΔΔCT表示。qPCR引物序列见表1。

表1 qPCR引物序列Table 1 Primer sequence of qPCR

1.3.3Ob-Rb蛋白表达检测(Western blot法)：取股骨外侧髁软骨100 mg，用RIPA裂解液提取总蛋白，BCA法测定其浓度和纯度，取适量样品进行SDA-PAGE。蛋白在SDA-PAGE电泳下分离，电转移至硝酸纤维素膜，5%脱脂奶粉室温封闭2 h，一抗稀释液中4℃过夜，洗膜3次，二抗稀释液中室温孵育1 h，洗膜后加入ECL试剂反应1 min，X线曝光。以β-actin作为内参对照，Image J软件对条带进行灰度扫描，以目的条带与β-actin的平均吸光度比值表示蛋白水平，进行半定量分析。

1.4 统计学处理

2 结果

2.1 各组兔血清及关节液瘦素含量比较

实验过程中，模型组、透明质酸钠组和青藤碱组兔各死亡1只，各组实验兔最终为空白组8只，其余3组各9只。ELISA检测结果显示：模型组和透明质酸钠组血清瘦素含量较空白组明显升高，差异有统计学意义(分别为P<0.01，P<0.05)，青藤碱组血清瘦素含量显著低于模型组和透明质酸钠组，差异有统计学意义(分别为P<0.01，P<0.05)；模型组、透明质酸钠组和青藤碱组关节液瘦素含量较空白组均明显升高，差异有统计学意义(分别为P<0.01，P<0.01，P<0.05)，但青藤碱明显低于模型组和透明质酸钠组，差异有统计学意义(分别为P<0.01，P<0.05)，见表2。

表2各组兔血清及关节液瘦素浓度比较(μg/L)
Table2Comparison of levels of leptin in serum and synovium between each group(μg/L)

组别n血清关节液空白组80.599±0.0230.677±0.100模型组90.759±0.030∗∗1.030±0.124∗∗透明质酸钠组90.709±0.054∗0.935±0.055∗∗青藤碱组90.620±0.129##Δ0.789±0.044∗ ##Δ

注：与空白组比较，*为P<0.05，**为P<0.01；与模型组比较，#为P<0.05，##为P<0.01；与透明质酸钠比较，Δ为P<0.05

Note： Compared with control group,*P<0.05,**P<0.01; Compared with model group,#P<0.05,##P<0.01; Compared with HA group,ΔP<0.05.

2.2 各组软骨Ob-Rb mRNA表达比较

与空白组比较，模型组和透明质酸钠组Ob-Rb mRNA均呈高表达，差异有统计学意义(P<0.05)；青藤碱组Ob-Rb mRNA表达水平低于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)；青藤碱组与空白组比较无明显差异(P>0.05)。见图1。

图1 各组软骨Ob-Rb mRNA表达水平Fig.1 Expression of Ob-Rb mRNA in cartilage in each group注：与空白组比较，*为P<0.05；与模型组比较，#为P<0.05；与透明质酸钠比较，Δ为P<0.05Note: Compared with control group, *P<0.05; Compared with model group, #P<0.05; Compared with HA group, ΔP<0.05.

2.3 各组软骨Ob-Rb蛋白表达比较

模型组Ob-Rb较空白组明显呈高表达，差异有统计学意义(P<0.01)；青藤碱组和透明质酸钠组显著低于模型组，有极显著差异(P<0.01)；青藤碱与空白组及透明质酸钠组比较无统计学意义(P>0.05)。见图2。

图2 各组软骨Ob-Rb蛋白表达水平Fig.2 Expression of Ob-Rb protein in cartilage in each group注：与空白组比较，**为P<0.01；与模型组比较，##为P<0.01 Note: Compared with control group, **P<0.01; Compared with model group, ##P<0.01.

3 讨论

瘦素是由肥胖基因编码的肽类激素，主要由白色脂肪组织分泌。正常软骨通常不表达瘦素，而瘦素及Ob-Rb在进行性OA患者软骨及滑液中的表达显著提高[4]。研究发现，关节液中瘦素浓度与影像学显示的OA患者关节破坏程度紧密相关[5]。Simopoulou等[4]观察了Ob-Rb在体外培养的正常软骨细胞、OA患者损伤区软骨细胞及OA患者损伤邻近区软骨细胞的mRNA及蛋白表达，结果发现OA软骨Ob-Rb表达水平显著高于正常软骨，严重损伤区软骨Ob-Rb表达水平明显高于轻度损伤区。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)是一组能够降解细胞外基质的内肽酶，在OA软骨基质降解期发挥重要作用[6]，瘦素可诱导OA关节软骨表达MMP-9和MMP-13[7]。研究发现，瘦素诱导下的人软骨细胞IL-8的表达量显著提高[8]，瘦素还可独立或与IL-1β协同作用，通过NF-κB、蛋白激酶C和MAP激酶信号通路，上调MMP-1和MMP-3在OA患者软骨的表达，这一机制与OA患者滑液中高浓度的MMP-1和MMP-3直接相关[9]。

清风藤为防己科藤本植物青藤的藤茎，性味辛、苦、温，入肝、脾经，具有祛风湿、通经络等功效。青藤碱是清风藤的主要活性成分。临床研究表明，青藤碱可缓解OA患者膝关节疼痛、肿胀及晨僵等症状，显著改善膝关节功能障碍[10-11]。青藤碱膝关节腔注射可降低关节液中TNF-α、IL-1β、IL-6及PGE2含量，延缓软骨退变进程，提示青藤碱对OA软骨具有保护作用，其机制可能与其抗炎作用有关[12-14]。

本实验ELISA结果表明，青藤碱关节腔注射可显著降低KOA兔血清及关节液瘦素水平。软骨Ob-Rb基因和蛋白表达检测结果显示，KOA兔软骨中Ob-Rb呈高表达，与文献报道一致，青藤碱关节腔注射可明显下调Ob-Rb在软骨的表达。以上结果提示，降低血清及关节液瘦素含量以及下调Ob-Rb在软骨的表达可能是青藤碱关节腔注射治疗OA的机制之一。