缓激肽B2受体基因多态性对膝关节骨关节炎易感性的影响

陈烁 周利武 张雷 赵云龙 杨超 赵建宁*

1. 南京军区南京总医院 骨科， 江苏 南京 210002 2. 南京大学医学院临床学院 骨科， 江苏 南京 210000

缓激肽B2受体(BDKRB2)广泛分布于人体组织包括关节内，调控大部分缓激肽引起的炎症反应[1]。研究报道BDKRB2基因多态性与一系列病理状态联系紧密，如冠心病、糖尿病[2]、肺动脉高压[3]，以及高血压引起的左心室肥大[4]。尽管BDKRB2在炎症中的作用已被阐明，但BDKRB2基因多态性与OA的关系几乎未见报道。本实验目的在于明确BDKRB2基因多态性与OA易感性的关系，并观察BDKRB2基因多态性在OA患者滑膜组织中对BDKRB2表达的影响。

1 材料和方法

1.1 对象

本实验纳入对象为2013年2月至2014年12月我院收治的278名膝关节OA患者，以及291名健康受试者作为对照。实验取得所有参与人员的知情同意，经过我院伦理委员会审查通过。膝关节OA的诊断采用美国风湿病学会标准[5]，OA的严重程度采用Kallgren-Lawrence(KL)分级。实验组对象排除其他类型关节炎，对照组对象无关节炎病史，无关节疼痛、肿胀、活动受限等关节症状。统计所有对象的风险因素，包括年龄、性别、体重指数(BMI)、吸烟状况、膝关节活动度和运动情况。将肥胖标准定义为BMI>30。

1.2 BDKRB2基因多态性分型

用DNA分离试剂盒(Qiagen,Valencia, CA, USA)从外周血提取DNA100 ng，25 μL反应缓冲液内含0.2 mmol/L碱磷酸脱氧核苷酸，1.0 mmol/LMgCl2，20 mmol/LTris/Cl(pH=8.4),50mmol/L KCl，0.015 nmmol/L正反向引物和0.5UTaq聚合酶(Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, USA)。反应条件： 94℃预变性1 min后进入40个循环，每个循环包括60℃(+9/-9)或者57℃(C -58T)退火30 s、72℃延伸10 s、最后在G-Storm热循环中72℃延伸5 min。BDKRB2+9/-9多态性引物序列为：正5-TCCAGCTCTGGCTTCTGG-3；反5-AGTCGCTCCC TGGTACTGC-3，扩增产物为80bp(-9)与89bp(+9)。BDKRB2 C -58T多态性简并引物序列为：正 5-AAGGTGGCCGCAGCCTTCC-3；反5-AGTCGCT CCCTGGTACTGC-3[6]。反向引物包含一处G-C颠换，产生限制性核酸内切酶Bfa的识别位点(5-CTAG-3)，在C等位基因存在时，将133bpPCR产物分解成112+21bp。用电泳将所有PCR产物根据大小进行分离，聚丙烯酰胺凝胶浓度为8%，电泳缓冲液为1×Tris-硼酸，溴乙锭染色，紫外灯下观察鉴定基因型。等位基因和基因型频率用χ2检验和Fisher精确检验进行对比，P<0.05视为有统计学意义[7]。

1.3 实时定量PCR

从156个接受关节置换手术的OA病人中获取滑膜组织，从滑膜组织中提取的RNA用SuperScript First-Strand cDNA合成试剂盒(Invitrogen, Grand Island NY, USA)逆转录为cDNA，基因表达使用PrimeTime Mini qPCR Assays (Integrated DNA Technologies, Iowa, USA)进行实时定量PCR测定。PCR反应根据说明在ABI PRISM 7900HT测序系统 (Applied Biosystems)中进行。BDKRB2的表达与3个管家基因HPRT1, GAPDH 和18S的平均表达作比较：对每一个cDNA样本作3次重复，然后对18S (n=3)，GAPDH(n=3) 和 HPRT1 (n=3), 与BDKRB2 (n=3)一起进行实时定量PCR。3个管家基因Ct的平均值(3x3)作为对照与BDKRB2进行对比。BDKRB2相对于管家基因的的表达用2-ΔCt的方法来表示。用秩和检验评价+9/-9和-58C/T基因型的BDKRB2的表达相对于对照是否有统计学差异。所有引物和探针序列见表1。

表1 BDKRB2定量PCR中各基因引物序列和探针Table 1 The primers for quantitative PCR analysis of BDKRB2

1.4 蛋白质印迹分析

从滑膜组织中提取的蛋白使用SDS-PAGE电泳，分离的蛋白通过电转膜的方法转至PVDF膜上(Millipore, Bedford MA, USA)。膜上的非特异性蛋白使用含0.1%Tween，5%无脂牛奶的PBS20 mL封闭1 h，然后与兔抗人BDKRB2-抗(Sigma-Aldrich, St. Louis MO, USA)进行孵育，然后与合适的能与HRP免疫性结合的二抗进行孵育(GE Healthcare, Buckinghamshire, UK)。免疫结合的蛋白使用增强化学荧光(ECL)试剂(Amersham Pharmacia, Piscataway, New Jersey, USA)处理后进行观察。

1.5 统计学处理

χ2检验对比实验组与对照组之间的基因型频率和人口分布，如各SNP均与OA独立相关则用多元逻辑回归分析模型评价。计算比值比(ORs)和95%可信区间，用SPSS19.0进行分析。

2 结果

2.1 参与者特性

OA患者的BMI明显高于对照组(P=0.001)，但在其他人口学特征和临床特征方面，如性别、年龄、吸烟状态、体力劳动情况等，并无明显差异(表2)。

2.2 -9/-9基因型患OA风险更高

OA组和对照组中BDKRB2基因多态性的基因型分布和等位基因频率如表3所示。所有多态性的基因型频率分布符合哈-温平衡(P>0.05)。BDKRB2 -58T/C基因型和等位基因频率在OA组和对照组无明显差异。但是OA组中-9/-9基因型明显高于对照组(33.46% vs 20.07%)，同时OA组中-9等位基因频率也明显高于对照组(57.754% vs 47.34%,P<0.001)。逻辑回归分析显示，经过性别、年龄、BMI、吸烟状况、家族史和劳动情况等变量调整后，-9/-9基因型相对于+9/+9基因型患OA的风险显著增高(OR=2.35，95% CI: 1.409～3.937，P<0.001)。调整后-9等位基因的比值比(OR)显著高于+9等位基因(OR=1.52, 95% CI: 1.186～1.947,P<0.001)。

表2 实验对象的人口学特点和临床特征Table 2 Demographic and clinical characteristics of all subjects in the study

注：OA：骨关节炎；KL：Kallgren-Lawrence；ns：无显著差异；*：有显著差异

表3 BDKRB2基因型分布和等位基因频率Table 3 Genotype distribution and allele frequency of BDKRB2 polymorphism in OA and control subjects

注：OA：骨关节炎；OR：比值比

2.3 -9等位基因患严重OA风险更高

用KL分型将OA患者分为KL评分≤3和>3两组，分析两组间基因型和放射学分型的差异(表4)。研究发现+9/+9基因型在KL评分≤3和KL评分>3两组间差异明显(P< 0.001)。+9/-9和-9/-9基因型患严重OA(KL评分>3)的风险更高(OR=2.825,P=0.003，和OR=2.94,P=0.004)。因此-9基因型患严重OA风险更高(OR=1.545,，P=0.011)。-58T/C在两组间无明显差异。

表4 OA患者BDKRB2基因多态性和放射学分级Table 4 The BDKRB2 polymorphisms and the radiographic severity of OA patients

图1 不同KL分级的OA患者滑膜组织中BDKRB2 mRNA水平n为各分组中患者数量，水平线代表平均值和标准差，用秩和检验计算P值 Fig.1 The BDKRB2 mRNA level in synovial tissues from patients with OA according to Kellgren-Lawrence (KL) grade. n is the number of patients studied in each group. The horizontal lines in each plot represent the mean and the standard deviation (SD) of the mean. P-values were calculated using a Kruskal-Wallis test

2.4 BDKRB2 mRNA和蛋白质水平

实验表明滑膜组织中BDKRB2 mRNA水平与OA的放射学分级相关(图1)。KL4级患者的BDKRB2 mRNA平均水平(2.502±1.319)明显高于KL3级和2级患者(1.471±1.002 or 1.895±1.174,P<0.001)。实验中根据BDKRB2基因多态性基因型的不同，研究滑膜组织BDKRB2 mRNA水平。研究发现+9/+9基因型滑膜组织中BDKRB2 mRNA水平明显低于+9/-9和-9/-9基因型(0.723 ±0.357 vs. 2.128 ±1.196和2.486 ±1.203，P<0.001)。而-58T/C基因多态性并不影响滑膜组织BDKRB2 mRNA水平(图2)。Western blot显示-58TT、-58TC和-58CC三种基因型滑膜组织中BDKRB2 mRNA水平无明显差异，而+9/-9和-9/-9基因型滑膜组织中BDKRB2 mRNA水平明显高于+9/+9基因型(图3)。

图2 不同BDKRB2基因型的OA患者滑膜组织中BDKRB2 mRNA水平n为各分组中患者数量，水平线代表平均值和标准差，用秩和检验计算P值 Fig.2 The BDKRB2 mRNA level in synovial tissue from patients with OA according to the genotypes of the BDKRB2 gene polymorphism. n is the number of patients studied for each group. The horizontal lines in each plot represent the mean and the standard deviation (SD) of the mean. P-values were calculated using a Kruskal-Wallis test

图3 用免疫印迹分析检测不同基因型OA患者滑膜组织中BDKRB2蛋白水平上图为不同基因型OA患者滑膜组织中BDKRB2抗体的免疫印迹分析结果；下图为BDKRB2/GAPDH比值的密度计分析，GAPDH作为加载控制器，结果用平均值±标准差表示Fig.3 The BDKRB2 protein level in synovial tissue from different genotype carriers by Western blotting analysis. The above panel shows representative Western blotting of BDKRB2 antibodies in the synovial tissue from different genotype carriers. The under panel shows densitometric analysis of BDKRB2/GAPDH ratio. Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) was used as a loading control. The data are presented as mean ±SD

3 讨论

骨关节炎(OA)是关节炎中最常见的一种类型，是一种慢性、退行性关节疾病，涉及关节内所有结构包括骨、软骨和滑膜等，其中最主要的特征是软骨退变[8,9]。流行病学研究证明多个危险因素与OA的易感性有关，但诱发OA的具体机制尚不清楚。研究表明年龄、创伤、激素和机械因素均与OA的发生和发展有关[10]。除了上述传统的发病诱因，有研究提示某些基因多态性也和OA的发病机制密切相关[11-13]。据报道在膝关节OA患者中应用缓激肽B2受体拮抗剂能产生持久的镇痛效果，提示缓激肽可能在OA发展中有重要作用[14]。

近年来大量研究显示，缓激肽(BK)在多种生理状况中有重要的调节作用，如炎症、血管通透性、高血压、水肿、平滑肌收缩和糖稳态[15,16]。众所周知BK绝大多数生理学效应是由BDKRB2介导[15]，而BDKRB2存在于绝大多数组织，通过提高NO的生成和释放调节血管舒张和炎症反应[17, 18]。BDKRB2在BK生理效应中起到至关重要的作用，而目前关于BDKRB2遗传多样性对OA发病机制的影响尚属空白。

本研究分析了中国人群中BDKRB2基因多态性对OA易感性和严重程度的影响。人类的BDKRB2基因位于染色体14q32[19]，基因含有数个多态位点，在基因的第一个外显子有9个碱基对的插入点/缺失点(+9/-9，rs5810761)，启动子区有C-T转换点(C -58T，rs1799722)[20]。相比-58T/C多态性，+9/-9多态性不仅与OA患病风险相关，而且能影响罹患OA的严重程度。

研究结果表明，+9/-9和-9/-9基因多态性的患者罹患严重OA的风险较高。此外，BDKRB2多态性-9等位基因与滑膜组织中BDKRB2 mRNA和相关蛋白的高表达有关[21]。BDKRB2基因多态性与OA易感性和严重程度得到进一步验证。