壮骨方对糖尿病大鼠骨质疏松的防治及其对血清IGF-1、TNF-α水平的影响

粟麟 李双蕾 陈文辉 马汝洁 莫文秋

1. 广西中医药大学研究生院，南宁 530001 2. 广西中医药大学第一附属医院，南宁 530001 3. 要江苏连云港市赣榆区中医医院，连云港 222100

糖尿病性骨质疏松症(diabetic osteoporosis，DOP)是因糖尿病(diabetes mellitus，DM)高血浆葡萄糖水平的内环境下并发的骨吸收与骨形成失衡致使骨量减少、骨显微结构受损、骨强度降低，骨折风险增加[1]。中医认为DOP属于“骨痿”、“骨痹”等范畴，病位在肾，与肝、脾密切相关联，性属本虚标实，其主证为肾虚脾亏、脉络瘀阻。其治疗规律不同于一般骨痿，应以消渴为本，骨痿为标。壮骨方以补肾壮骨、益气健脾、活血通络佐益气养阴为法，在骨痿病性的基础上兼顾消渴气阴两虚的特点。经临床观察对2型糖尿病合并骨质疏松症具有较好的疗效[2]，但对其疗效的现代机制研究尚不足。胰岛素样生长因子1(insulin-like growth factor，IGF-1)是促细胞分化增殖作用以及刺激后成骨细胞分化增强的因子，在促进成骨细胞生成、分化、增强其活性方面具有重要作用[3-4]；肿瘤坏死因子α(tumour necrosis factor，TNF-α)作为重要的炎性因子，介导炎性过程导致骨量丢失，起着关键性作用而受到研究者们的关注[5]。本研究通过动物实验从血清IGF-1、TNF-α表达水平等方面探讨壮骨方防治DOP的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康SPF级雄性SD大鼠70只，体重(161±6.56)g，实验动物许可证号：SCXK桂2009-0002，大鼠饲养于广西中医药大学实验动物中心动物房，室温25℃～28℃，通风，自然采光，大鼠自由进食、饮水。所有实验动物饲料均由广西中医药研究所提供。

1.2 主要试剂和仪器

酶联免疫吸附法(Elisa)检测试剂盒(苏州卡尔文生物科技有限公司)；血糖仪(德国罗氏血糖仪公司)；Discovery-A型双能X线吸收骨密度仪(美国HOLOGIC公司)；倒置显微镜、半自动图像数字化分析仪(日本OLYMPUS公司)；酶标仪(芬兰Labsystems Multiskan)。

1.3 药品

壮骨方(淫羊藿、枸杞、黄芪、骨碎补、杜仲、牛膝、山药、白术、丹参、田七、甘草组成，采用江阴天江药业有限公司生产的单味中药浓缩颗粒剂)；盐酸二甲双胍片(江苏苏中海欣制药有限公司生产，批准文号：国药准字H32021625；生产批号：12123012)；链脲佐菌素(美国sigma化学制剂公司)；水合氯醛(国药集团化学试剂有限公司)。

1.4 方法

1.4.1动物模型建立：适应性喂养1周后，随机将70只大鼠分为空白组(Blank 10只)、造模组(60只)。造模组给予高脂饲料，空白组给予普通饲料，喂养4周后，予以禁食12 h，造模组一次性腹腔注射2%STZ(35 mg/kg)，空白组腹腔等量注射0.1 mol/L柠檬酸盐缓冲液。72 h后断尾取血测定空腹血糖，以空腹血糖≥16.7 mmol/L视为2型糖尿病大鼠模型造模成功，共54只大鼠造模成功。

1.4.2动物分组及给药方法：随机挑选50只2型糖尿病造模成功大鼠随机分为5组：模型组(DM)、二甲双胍组(DM+MET)、壮骨方低剂量组(DM+MET+ZGF-L)、壮骨方中剂量组(DM+MET+ZGF-M)、壮骨方高剂量组(DM+MET+ZGF-H)，各10只。DM+MET组用盐酸二甲双胍片以157.5 mg/kg用蒸馏水溶解灌胃。壮骨方3个剂量组在与DM + MET组使用同等剂量盐酸二甲双胍灌胃的基础上分别以壮骨方高、中、低剂量灌胃，其中不同剂量组别分别含生药3 g/ml、1.5 g/ml、0.75 g/ml。空白组及模型组等量蒸馏水灌胃。各组大鼠灌胃量均为1.5 ml/100 g，2次/天，灌胃后正常进食，经以上处理12周。

1.5 检测指标

1.5.1血清检测：分别于给药后第4、8、12周，麻醉下眶缘静脉取血，室温静置后离心(3000 r/10 min)分离血清，用酶联免疫吸附法(Elisa法)测定血清IGF-1、TNF-α水平，按Elisa试剂盒说明书操作。

1.5.2骨密度(BMD)测定：由广西壮族自治区人民医院骨密度室专业人员操作完成，采用美国HOLOGIC公司Discovery-A型双能X线吸收骨密度仪，扫描软件为小动物软件(版本：3.9.4)，测量条件为：扫描速度60 mm/s，测定面积0.24 cm2。

1.5.3骨形态学及骨计量单位测定：给药后第12周，麻醉下腹主动脉取血处死大鼠，冰上剥离动物右侧后肢胫骨，剔除所有筋膜、软组织，用低速锯取上段备用。置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h，放入7%EDTA脱钙2周，流水冲洗24 h，乙醇中逐级脱水，正丁醇过夜，二甲苯透明，浸蜡，包埋，切片(5 μm)，使用图像分析系统测量以下参数：骨小梁面积(Trabecular Bone Area，Tb.Ar)；骨小梁周长(Trabecular Surface，Tb.Pm)；骨小梁面积百分比(Percent Trabecular Area，%Tb.Ar)；骨小梁数量(Trabecular Number，Tb.N)；骨小梁分离度(Trabecular Separoation，Tb.Sp)。

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 血糖

给药后对各组的FBG水平监测显示(表1)，DM组血糖水平明显高于其他各组，壮骨方治疗组与二甲双胍组均可降低血糖(P<0.01)。壮骨方治疗组与二甲双胍组相比在第4周、第8周血糖水平无明显差异(P>0.05)，但是第12周壮骨方高剂量组FBG水平低于同期单纯二甲双胍治疗组(P<0.01)。

表1 壮骨方对2型糖尿病大鼠FBG水平的影响Table 1 Effect of ZGF on FBG in type

注：与空白组比较：○P<0.05，●P<0.01；与模型组比较：△P<0.05，▲P<0.01；与二甲双胍组比较：☆P<0.05，★P<0.01

2.2.1给药12周后骨密度结果：给药12周后，给药后对各组的骨密度检测显示(表2)，DM组骨密度值(0.1496±0.0061)g/cm2低于空白组(0.1796±0.0072) g/cm2，P<0.01；壮骨方治疗组骨密度值均高于模型组(P<0.01)，且呈剂量依赖性，其中低剂量组骨密度值为(0.1628±0.0057) g/cm2，中剂量组骨密度值为(0.1665±0.0052)g/cm2，高剂量组骨密度值为(0.1745±0.0062)g/cm2；二甲双胍组骨密度值(0.1590±0.0055) g/cm2高于模型组(P<0.05)。壮骨方高剂量组骨密度值高于单纯二甲双胍组(P<0.01)。

2.2.2给药12周后骨形态计量学静态参数结果：给药12周后，DM组Tb.Ar、Tb.Pm、%Tb.Ar、Tb.N明显下降，Tb.Sp增加(P<0.01)，壮骨方3个剂量组与二甲双胍组Tb.Ar、Tb.Pm、%Tb.Ar、Tb.N水平明显增加(P<0.01)；其中壮骨方高剂量组、中剂量组Tb.Ar、%Tb.Ar水平较二甲双胍组增加(P<0.05)；高剂量组Tb.Pm、Tb.N水平较二甲双胍组增加(P<0.05)，骨小梁分离度各组之间比较无明显差异(P>0.05)。见表2。

表2 给药12周后各组骨形态计量学静态参数结果Table 2 The result of bone histomorphometry parameters in each group after the treatment for 12 weeks n=10)

注：与空白组比较：○P<0.05，●P<0.01；与模型组比较：△P<0.05，▲P<0.01；与二甲双胍组比较：☆P<0.05，★P<0.01

2.3 血清IGF-1、TNF-α

第4、8、12周监测各组大鼠血清IGF-1(表3)、TNF-α(表4)水平后显示，治疗组较DM组血清IGF-1水平增高、TNF-α水平降低(P<0.01)，但比较各治疗组之间显示：壮骨方高、中剂量治疗组较二甲双胍组血清IGF-1水平增高、TNF-α水平降低(P<0.01)，壮骨方低剂量组与二甲双胍组之间比较无显著性差异(P>0.05)。

表3 壮骨方对2型糖尿病大鼠血清IGF-1的影响Table 3 Effect of ZGF on serum IGF-1 in type 2 diabetic rats n=10)

注：与空白组比较：○P<0.05，●P<0.01；与模型组比较：△P<0.05，▲P<0.01；与二甲双胍组比较：☆P<0.05，★P<0.01

表4 壮骨方对2型糖尿病大鼠血清TNF-α的影响Table 4 Effect of ZGF on serum TNF-α in type 2 diabetic rats n=10)

注：与空白组比较：○P<0.05，●P<0.01；与模型组比较：△P<0.05，▲P<0.01；与二甲双胍组比较：☆P<0.05，★P<0.01

3 讨论

DOP独特病理内环境增加了合并慢性炎症的风险和(或)炎症严重程度[6]，使骨矿物丢失增加[1]。Verhaeghe J等研究发现糖尿病大鼠血清1,25(OH)2D3结合蛋白显著下降，十二指肠钙吸收障碍，胫骨骨小梁数量下降44%，成骨细胞及其前体减少10%[7]。通过诱导大鼠产生2型糖尿病，通过双能X线吸收骨密度仪检测发现糖尿病模型组BMD较其他各组下降(P<0.05)，并对造模成功的DM大鼠胫骨组织切片通过半自动图像数字化分析仪观测到DM组大鼠较空白组大鼠骨小梁数量下降33%，小梁面积和周长减小(P<0.05)，确定2型糖尿病大鼠骨质疏松形成。

壮骨方(淫羊藿、枸杞、黄芪、骨碎补、杜仲、牛膝、山药、白术、丹参、田七、甘草等)中以淫羊藿温补肾阳，枸杞滋补肾阴，黄芪益气健脾用为君药，三药组合，阴阳双补，使肾精充沛，脾气健运，补益先天，调补后天。针对消渴并骨痿脾肾亏虚的根本病机发挥作用。研究发现，骨碎补总黄酮能增强成骨细胞活性与分化，另一方面调节下丘脑-垂体-性腺轴功能，提高体内雌激素水平，降低甲状腺激素水平，促进肠钙吸收和骨钙沉积[8]。此外Yin等[9]研究发现骨碎补苷具有降低核因子-κB及其受体激活剂(receptor activator of nuclear factor-κB-ligand，RANKL)表达抑制破骨细胞活性的作用。淫羊藿苷有通过增加TNF受体家族之一的骨保护素(OPG)mRNA的表达而使核因子-κB受体RANKL受到竞争性抑制，进一步阻碍破骨细胞分化和成熟，抑制骨吸收[10]。高血糖使炎性因子及RANKL表达增多，OPG表达下降。实验证实壮骨方高、中剂量组较二甲双胍组血清TNF-α、FBG水平显著下降，但低剂量组与之相比无明显差异，由此推测壮骨方呈剂量依赖性通过降低血浆葡萄糖水平与其中所含淫羊藿苷使OPG表达增多竞争性结合TNF-α因子使血清TNF-α水平有关；骨碎补总黄酮及骨碎补苷增强成骨细胞活性、促进肠钙吸收，抑制破骨细胞分化、成熟，抑制骨破坏。

研究发现，糖尿病患者即使骨量、骨密度正常或升高也因IGF-1水平下降而致使骨折风险增加[11]，因此IGF-1成为评估骨质疏松和骨折风险的因素之一[12]。IGF-1由肝细胞合成和释放，与其受体IGF1R在调控蛋白的作用下分布于血清入循环和局部骨组织而发挥其活性，在骨结构形成过程中调控软骨细胞的肥大促进纵向骨生长[13]，同时也直接或间接介导体循环中生长激素而促进成骨细胞的增殖、分化和骨结构的形成[14-15]。近年来研究者们通过直接补充人重组IGF-1或间接升高体内IGF-1水平的方式达到控制骨重吸收，抑制骨量减少，增加骨强度降低骨折风险等目的[16-18]。笔者通过监测给药过程中各组血清IGF-1，发现壮骨方高、中剂量治疗组IGF-1水平明显高于二甲双胍组，结合其骨计量参数结果，推断壮骨方可能通过升高机体内血清IGF-1水平而维持骨微结构，且这种作用呈现出剂量依赖性。

通过动物实验，得出壮骨方防治2型糖尿病骨质疏松的可能机制为通过降低血糖、升高血清IGF-1、降低血清TNF-α水平促进骨形成抑制骨吸收。但是其作用表现出剂量依赖性，提示进一步进行药物最大有效量及相关药物毒理研究。随着细胞分子研究的开展，壮骨方对成骨细胞及破骨细胞的作用信号通路仍有待探明。