一种新的基于细胞局部图特征和运动特征的细胞跟踪算法

朱　辰　周庆利　何剑虎

(浙江大学医学院附属妇产科医院　浙江 杭州 310006)



一种新的基于细胞局部图特征和运动特征的细胞跟踪算法

朱辰周庆利何剑虎

(浙江大学医学院附属妇产科医院浙江 杭州 310006)

摘要在跟踪显微序列图像中的细胞时，由于存在细胞分裂、粘连运动不均匀等问题，影响细胞分割和跟踪的准确性。为了提高细胞跟踪的准确率，提出一种新的跟踪算法，用于分析显微序列图像中细胞的形态变化和动态变化。该算法对移动距离不大的细胞采用由细胞位移、面积和形变构成的细胞区域特征来实现该类细胞的跟踪，然后再利用已成功实现跟踪的细胞，构造由细胞之间拓扑关系组成的局部图，最终使用基于局部图特征和细胞区域特征构成的混合跟踪算法实现活跃细胞的跟踪，并对跟踪过程中的各种情况进行分析处理。用两个视频序列验证该方法的有效性，实验结果表明，该算法能够提高细胞跟踪的准确率分别为10%和6%。

关键词细胞分割细胞跟踪聚集细胞局部图时间序列图像

0引言

研究细胞的运动是细胞研究中重要的组成部分之一，对于揭露细胞行为(细胞迁移、细胞增殖、细胞死亡和凋亡等)的本质和研究生物过程都起到了非常重要的作用[1]。然而由于显微细胞图像存在图像模糊、细胞分布杂乱等特点，通过传统的人工方法分析显微镜下拍摄的大量图片是一件冗长乏味的事情，而且随着细胞图像数据的不断增加和重复观察的需要，显然人工分析的方法是一项不切实际的方法。有时候由于使用了物理化学等操作使实验结果不能够正确地反映细胞的自然运动，因此传统的细胞跟踪方法在技术日益更新的今天已不再适用。然而跟踪细胞的运动是一项极具挑战性的工作。在细胞的追踪过程中，由于显微图像和细胞自身的特点及细胞之间具有的相似性，会出现细胞重叠、分裂、融合、新出现细胞和细胞消失等现象，从而导致误追踪。为了解决这些问题，国内外的研究者做了相当多的工作，总体上可以把这些研究的方法分为三类：

第一类是基于细胞形状描述的参数模型的跟踪方法。主动轮廓模型[2-4]、mean-shift[5，6]和Level-set[7-11]算法就属于这一类。但是，主动轮廓模型和mean-shift算法无法处理细胞分裂的情况，而且对于密集细胞、移动速度很快的细胞和细胞边缘模糊会出现误匹配的问题。Level-set 方法可以解决细胞分裂过程中拓扑结构变化的情况，但是如果出现快速移动的细胞或者细胞从视野中消失或出现时，就需要再次初始化，否则无法再次实现细胞的准确追踪。此外，当细胞移动到距离很近的时候，基于参数模型的方法需要采取另外的操作来阻止细胞的边界合并起来。

第二类是基于细胞分割与检测的方法。这种方法由分割和跟踪两部分组成。先根据细胞图像亮度、纹理、强度的特点，采用图像分割技术检测出每一帧中的细胞，然后在连续的两帧中把细胞一一匹配，直到最后一帧，最终达到追踪的目的。采用梯度边缘检测的方法检测细胞，通过相邻细胞之间的关系建立图的模型完成细胞的追踪，但是这种方法由于细胞检测的错误会改变细胞之间的拓扑关系，因此可能导致追踪的错误[12]。还有就是用分水岭的方法来检测细胞[13]，但是这种方法在细胞分割的过程中会出现过分割和欠分割的情况，而且分割后的形状和大小也不能够完全表示原来细胞的大小，最终会导致检测的错误，也不能利用这些信息完全处理细胞形状变化、运动变化和分裂的问题。

第三类是基于概率论的方法[14，15]。尽管这种方法非常适合于粒子追踪，但是用来追踪显微镜中细胞还不具有稳定性。

由于规范具有不同形状和运动特征的细胞需要大量的假设条件，因此，在追踪细胞的各种形状变化时会遇到困难。而且，基于概率论的方法无法处理细胞分裂的情况，所以把概率论的方法应用到细胞的跟踪中，往往不能取得很好的跟踪效果。

针对传统的细胞跟踪算法存在跟踪准确度不高的问题，本文把图论的思想融入到细胞追踪中，研究提出的是一种基于细胞局部图特征和运动特征的细胞跟踪算法。对活跃程度不同的细胞进行分别跟踪，对移动距离小的细胞采取基于细胞区域特征的算法实现此类细胞的跟踪。在跟踪成功细胞的基础上，把基于细胞区域特征和局部图特征结合在一起形成一种新的细胞跟踪算法实现其余细胞的跟踪。克服了只用图论算法只能跟踪细胞拓扑结构变化很小和基于参数模型的跟踪算法不能追踪细胞分裂的缺点。最终试验结果表明，本文提出的算法在提高细胞跟踪准确度和细胞分裂的判断取得了显著的效果。

1细胞图像分割

显微细胞图像的准确分割是显微细胞动态分析中研究的关键环节和难点之一，往往需要针对不同的细胞图像类别采取不同的分割方法。由于细胞图像本身具有复杂的自然属性和结构特性如光照的影响、边界模糊、信噪比低、重叠细胞等问题，传统的基于边缘检测和区域的方法在细胞图像分割中往往很难得到理想的分割结果[16，17]，因此很少被采用。相反基于阈值的方法和基于模型的方法在显微细胞图像分割中具有很大的优势，能更有效地提取细胞区域，因此本文主要采用这两类方法进行细胞图像的分割。

本文研究采用的两种细胞视频，一是从生物相关视频库中获取的组蛋白家族之一的pAFV细胞荧光视频和英国剑桥大学肿瘤细胞研究所提供的膀胱癌T24相称显微(Phase-Microscopy)细胞视频。借助于MATLAB中图像处理工具箱，分别将视频转换得到连续的不同时刻的细胞图像。如图1(a)所示是pAFV细胞图像序列中第19帧的原图像。从图中可以看出细胞目标区域与背景区域有很明显的对比度，因此运用基于OSTU阈值的细胞图像分割方法就可以把潜在的细胞区域从背景区域中提取出来。图1(b)显示了细胞图像的分割结果。膀胱癌T24图像序列中的第64帧图如图2(a)所示。从原图中可以看出，细胞目标区域与背景区域的对比度不明显，有的细胞周围还存在光环和伪影，采用传统的基于阈值的分割方法，不能很好地分割这类图像，因此需要先用高斯滤波器对图像进行预处理，然后采用水平集的方法得到细胞的区域轮廓。本文选择Li提出的一种改进的不需要重新初始化轮廓的能量水平集算法。图2(f)是利用Li提出的改进的水平集方法对膀胱癌T24细胞图像序列中第64帧图像经过2500次迭代后得到的实验结果，细胞的边缘轮廓用深色线表示。

从图1(b)和图2(f)可以看到，分割结果中还存在孤立细胞、细胞聚团和粘连现象，并且一些噪点没有去除，采取我们以前提出的形态学处理方法进行处理，最终得到的分割结果如图3所示。

图1　pAFV细胞图像的分割

图2　第64帧膀胱癌细胞图像分割

图3　细胞图像序列分割最终结果

2细胞跟踪

细胞跟踪算法的过程是首先在细胞序列图片的第一帧中进行区域标记，并标记不同的标号。在下一帧中找到各个细胞相应的匹配细胞，然后进行符号标记，直至最后一帧结束。但是由于细胞数量多、细胞之间区别比较小、细胞分裂等特征，对于活跃细胞只运用细胞的运动特征(位移变化参数Edisplacement，面积变化参数Earea和形状变化参数Edeformation)很难发现正确的细胞匹配对，常常出现误追踪。为了克服这种问题，我们把活跃程度不同的细胞进行分类跟踪，将细胞的局部图特征和运动特征结合起来完成活跃细胞的跟踪。

2.1特征参数

描述细胞运动特征的参数主要有位移变化参数Edisplacement、面积变化参数Earea和形状变化参数Edeformation这些参数在文献[18]中已经证明在细胞跟踪中能够取得很好的效果。

(1) 位移变化参数Edisplacement反映了细胞在相邻两帧图片之间的移动距离大小，可以用式(1)来计算：

(1)

式中H和W分别是图像的高度和宽度。Di,j表示细胞i和细胞j之间的欧式距离，可以用式(2)计算：

(2)

式中(xi,yi)和(xj,yj)分别表示细胞i和细胞j的坐标。

(2) 面积变化参数Earea反映了细胞在相邻两帧图片之间的变化大小，其计算方式如式(3)所示：

(3)

(3) 形状变化参数Edeformation表示细胞在相邻两帧之间的形状变化，其计算方式如式(4)所示。

(4)

式中Q=(4πArea)/Perimeter2，Qit和Qjt+1分别表示细胞i和细胞j在t和t+1时刻的圆形度。

除了细胞运动特征参数之外，为了克服活跃细胞的跟踪问题，我们将局部图的体征引入到跟踪算法中。把局部图的建立方法运用到细胞图像中，需要考虑构造的局部图能否充分反映细胞之间的关系，所以我们把图中的顶点用来表示图像中的一个细胞，相邻的细胞用一条边连接。然后对于相邻两个细胞之间连系的紧密程度则可以用权值的大小来反映。如图4所示分别在t帧和t+1帧中以细胞ci和细胞cj的中心建立一个局部图。局部图结构中自动包含了细胞之间的相对位置关系，比如相对距离和方向的大小。如果细胞没有发生分裂，则局部图的拓扑关系不会发生很大的改变。因此我们可以借助两个局部图的特征来完成t帧和t+1帧中部分细胞的匹配。后面基于局部图特征的细胞跟踪会用到局部图之间相似性度量这个概念，在此给出两个局部图之间的相似性度量EL(ci,cj)的计算方法[21]如式(5)所示。

图4　细胞局部图示意图

(5)

式中cki是细胞ci的相邻细胞，ckj是细胞cj的相邻细胞，lck i ,ci(t)和lck j ,cj(t+ 1)图中边的长度，θck i ,ci(t)和θck i ,ci(t) 是细胞ci和细胞cj与相邻细胞的连线与水平方向的角度[21]。

2.2细胞跟踪算法

本文为了提高细胞跟踪的准确率，把细胞局部图特征与细胞运动特征结合在一起，提出一种新的细胞跟踪算法，算法流程如图5所示。

图5　细胞跟踪算法流程图

2.2.1基于区域重叠法的惰性细胞跟踪

由于相邻帧之间时间间隔很小，有些细胞在前后帧中移动距离很小。我们通过计算t帧和t+1帧中细胞之间的欧式距离完成此类细胞的匹配。假设细胞i是在t帧中一个细胞，通过长度为细胞平均半径中心为细胞i的中心的圆形区域搜索找到细胞i的候选细胞。再利用式(6)计算细胞i与各个侯选细胞之间的相似度ER(ci,cj)。ER(ci,cj)最小的细胞j表明与细胞i重叠的区域最大，则认为细胞i和细胞j是一对匹配成功的细胞对。

ER(ci,cj)=λ1Edisplacement+λ2Earea+λ3Edeformation

(6)

式中ci和cj分别表示细胞i和细胞j，λ1、λ2和λ3表示细胞区域特征参数在相似度函数中的权重。他们取值范围在0和1之间，之和为1。

2.2.2基于细胞区域特征和局部图特征的活跃细胞跟踪

细胞的运动是无规则不均匀的运动，因此在细胞运动过程中，活性很强的细胞会发生跳跃运动[19，20]，即细胞在相邻两帧之间的移动距离比较大。之所以发生这种现象，是因为细胞内ATP分子的化学能在短时间间隔内转换为机械能[20]。对于这类细胞，运用基于区域特征的细胞跟踪方法往往会发生错误，因为在搜索待匹配细胞的候选细胞时是在一定区域内搜索的。而此时真正的候选细胞由于移动距离的变大已经超出了搜索的范围。因此，本文在基于区域特征的细胞跟踪方法的基础上研究基于细胞区域特征和局部图特征的细胞跟踪算法。在介绍具体的算法步骤之前先引入新的细胞匹配相似度E(ci,cj)的计算，E(ci,cj)的计算方法如式(7)所示：

E(ci,cj)=β1EL(ci,cj)+β2ER(ci,cj)

(7)

式中E(ci,cj)表示移动距离比较大的ci和cj相似度大小，ER(ci,cj)和EL(ci,cj)分别表示细胞区域特征相似度和局部图特征相似度。β1和β2表示细胞区域特征参数在相似度函数中的权重。他们取值范围在0和1之间，之和为1。

本文提出的基于细胞区域特征和局部图特征的细胞跟踪算法用于移动距离比较大的细胞跟踪。该算法是在基于细胞区域特征跟踪算法所成功跟踪细胞的基础上发展得来的，因此具有很高的准确性。结合图5中提到的基于细胞区域特征和局部图特征的细胞跟踪算法，给出的具体核心编程算法步骤如下：

(1) 采用全局搜索的方法搜索第一帧中遗留下的还没有匹配成功的细胞。

(2) 在下一帧中，根据没有被匹配成功细胞的质心求出与待匹配细胞的欧式距离L1，如果L1<4d(d是细胞运动的平均距离，通过对移动距离比较大的细胞进行统计，其移动距离不会大于4d)，则认为该细胞是待跟踪细胞的候选细胞，并记录所有的候选细胞信息。

(3) 分别在第一帧图中和下一帧图中以待匹配细胞和候选细胞为中心，以匹配成功的细胞对为相邻细胞建立两个局部图，并计算局部图相似度EL(ci,cj)。

(4) 对候选细胞中的所有细胞，再分别计算与待跟踪细胞之间的相似度E(ci,cj)(相似度可由式(7)计算得到)，则相似度值E(ci,cj)最小的候选细胞与待匹配细胞是一对细胞对，将当前帧中待匹配的细胞号赋给该候选细胞，并记录匹配成功的信息。

(5) 重复步骤(1)到(4)，直至完成第一帧中所有满足条件的细胞匹配。

(6) 再以第二帧为初始帧重复步骤(1)到(5)，直至所有帧结束，至此完成所有细胞的跟踪。

2.3细胞跟踪过程中各种情况分析

2.3.1细胞消失和新出现的处理

细胞追踪过程中存在比较重要的问题就是细胞消失和新出现。如果在当前帧中存在一个细胞没有找到与前一帧中能够匹配成功的细胞，则认为前一帧中的这个细胞是丢失的，并且记录丢失细胞的信息。产生丢失细胞的主要原因是细胞处在图像边缘处、细胞死亡和细胞重叠现象。对于细胞重叠的现象，根据前面记录的细胞丢失信息，则可以找到再次出现的细胞。

细胞的新出现是细胞跟踪过程中最常见的现象，因为细胞在运动过程中会发生细胞分裂，此外，细胞从图像边缘进入视野也是一个原因。在当前帧中，如果通过全局搜索发现了新的细胞，并且在前一帧中没有出现过，则认为该细胞是新出现的细胞，对新出现的细胞进行判断；如果不是图像边缘细胞，则认为是由于细胞分类产生的新的细胞，则记录这类细胞的信息，并给这类细胞分配新的细胞记号ID。细胞的分裂在细胞跟踪完成后进行处理，下面介绍处理的过程。

2.3.2细胞分裂检测

前面介绍的基于细胞区域和局部图特征的细胞跟踪方法是一对一的细胞匹配过程，因此对于细胞分裂的跟踪只能跟踪其中一个子细胞，而另外一个不能正常跟踪。为了对细胞分裂做出检测，首先研究细胞分裂时的特征。根据细胞生物学的理论知识，细胞分裂时会表现出如下特征[10]：

(1) 母细胞C发生分裂时，会分裂成C1和C2两个子细胞，这两个细胞中，其中一个细胞会被推离母细胞的位置，而另一个细胞还处在母细胞的位置上。

(2) 当母细胞要分裂成两个子细胞时，细胞会变圆、变亮。

(3) 两个子细胞的距离非常近。

(4) 子细胞的面积会变小，细胞C1和C2的面积之和与母细胞的面积相近。

因此，当细胞发生分裂时，可以先用基于细胞区域特征和局部图特征的方法跟踪其中的一个子细胞，再利用上面的分裂时特征来跟踪另外一个子细胞。在此需要说明一点是新出现细胞中是从边界进入视野的情况是需要排除的。

对与细胞分裂的检测，首先统计出当前帧和前一帧中的细胞个数N1和N2，如果除去由于边界细胞导致的新出现细胞的情况后，N1大于N2，则说明前一帧中的细胞发生了细胞分裂的情况。对与分裂细胞的跟踪过程如下：首先在当前帧中找到跟踪成功的一个子细胞C1，根据细胞分裂特征(3)，通过距离搜索找到另一个子细胞C2；然后计算细胞C1和C2的面积之和，根据细胞分裂特征(4)，如果两个子细胞的面积之和与母细胞的面积之差小于设定的阈值，则认为细胞C2是由母细胞C分裂出来的子细胞，并记录细胞分裂的信息。

3实验结果分析

在分割的结果上进行细胞的跟踪实验，分别对不同的两个细胞视频序列在Windows 2007下使用MATLAB 2010a编程完成。实验环境为：CPU主频是Intel(R) Xeon(R) 3.2 GHz ，内存8 GB，硬盘2 TB，显卡芯片NVIDIA Quadro 2000。 两个细胞分布不同的视频序列用于测试本文提出算法的有效性。第一个视频序列是由640×480像素的200帧光学显微镜荧光染色的pAFV细胞图像组成；第二个是与我们实验室合作的英国剑桥大学肿瘤细胞研究所提供的1600×1200像素的200帧的膀胱癌细胞灰度图像组成。pAFV细胞图像序列中由于细胞分裂存在细胞的个数越来越多，而由剑桥大学提供的膀胱癌T24相称显微细胞图像序列中细胞数量不多，甚至由于细胞的死亡，细胞的数量还会减少。如图6所示是pAFV细胞图像序列中第8～10帧跟踪结果的部分剪裁图。

图6　 pAFV细胞跟踪结果图

实验过程中式(7)中的权重参数β1和β2的取值与区域特征和局部图特征密切相关。对于细胞聚集比较疏的细胞图像β1取值大于β2，对于细胞聚集比较密的图像β2取值大于β1，本实验中细胞聚集比较均匀，因此β1和β2都取0.5。式(6)中α1、α2和α3直接与细胞活跃程度有关。移动距离大小是主要影响因素，面积变化程度和圆形度变化程度是次要影响因素，经过反复实验，式(6)中α1、α2和α3中的值分别是0.5、0.3和0.2，可以取得最好的跟踪准确性。从实验结果中可以看到文献[18]提出的细胞跟踪算法，在跟踪ID号为10的细胞时发生了错误。而本文算法在基于区域特征细胞跟踪算法的基础上局部图特征后很明显地能够纠正此类错误。

为了更好地说明本文提出算法的有效性，随机对pAFV细胞图像序列和膀胱癌T24相称显微细胞图像序列的跟踪准确率进行了人工统计，统计结果如表1和表2所示。从表中可以看出，本文提出的细胞跟踪算法在细胞跟踪准确率方面比文献[18]和文献[21]中的算法分别提高10%和6%左右。只是随着细胞跟踪的进行，由于细胞个数的不断增加(如pAFV细胞图像序列)和细胞死亡(如膀胱癌T24相称显微细胞图像序列)，细胞跟踪的准确率会有所下降。从pAFV和膀胱癌细胞图像跟踪的准确率中还可以看出，拍摄细胞视频的环境对细胞跟踪的结果有直接的影响。膀胱癌细胞视频中由于存在噪音会被误认为是细胞、细胞进入离开视野中和细胞分裂比较频繁是造成细胞跟踪准确率低的主要因素。

表1　pAFV细胞图像序列细胞跟踪准确率统计结果

表2　膀胱癌T24相称显微细胞图像序列的跟踪准确率统计结果

4结语

本文研究将局部图特征引入到细胞跟踪中，并根据细胞活跃程度的不同，实现分类追踪。对与移动距离小的细胞采取基于区域特征的细胞跟踪算法，对移动距离大的细胞采取基于区域特征和局部图特征的混合细胞跟踪算法，并对细胞跟踪过程中出现的细胞消失、出现和分裂等问题进行了修正。实验结果表明，本文提出的算法能够有效地实现对pAFV细胞图像序列和膀胱癌T24相称显微细胞图像序列中的细胞跟踪。实验结果表明该算法在跟踪准确率方面比其他算法有了明显的提高,因此为剑桥大学肿瘤细胞研究所的相关人员研究细胞的动态分析提供更好的基础。

在细胞跟踪的基础上，可以研究细胞的动态参数变化情况，如图7所示。细胞的动态参数主要包括细胞面积、数量、位移、速度、分裂等，这些参数在生物研究中都起到了重要的作用[22]，如伤口愈合实验、干细胞制造等。伤口愈合实验在生物学和医学的研究中应用非常广泛，在实验过程中，需要分析伤口愈合的过程即在不同的药物影响下观察细胞从伤口边缘向受伤区域迁移的过程。在此过程中通过定量分析大量细胞的面积和速度的变化从而发现新的有效的药物。而干细胞制造主要是为了满足疾病治疗过程中的需要，为了检测干细胞的培养情况，需要实时监控细胞的生长速度、细胞数量变化和细胞分裂快慢等。所以，研究细胞动态参数对于细胞动态分析非常重要。

图7　pAFV细胞动态参数变化

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收稿日期：2015-01-29。国家自然科学基金项目(61173096)。朱辰，硕士，主研领域：图形图像处理，医学图像处理。周庆利，研究员。何剑虎，高工。

中图分类号TP3

文献标识码A

DOI:10.3969/j.issn.1000-386x.2016.07.042

A NOVEL CELL TRACKING ALGORITHM BASED ON CELL LOCAL GRAPH FEATURE AND MOTION FEATURE

Zhu ChenZhou QingliHe Jianhu

(Women’sHospital，SchoolofMedicine，ZhejiangUniversity,Hangzhou310006,Zhejiang,China)

AbstractThe presence of cell division, adhesion and uneven movement affect the accuracy of cell segmentation and tracking when the cell in microscopic sequence images is tracked. In order to improve the cell tracking accuracy, this paper proposes a novel tracking algorithm used for analysing the morphological change and dynamical change of cell in microscopic sequence image. For those cells with little moving distance, this algorithm uses the cell region features consisted of cell displacement, area and deformation to achieve the track on them, and then makes use of these successfully tracked cells to construct the local graph composed of the topological relations between cells, and finally uses the hybrid tracking algorithm, which is constructed based on local graph features and cell region features, to achieve the track on the active cells, and analyses and processes various situations appeared during cell tracking process. Two video sequences are used to verify the effectiveness of this method. Experimental results show that the proposed algorithm can improve 10% and 6% in cell tracking accuracy respectively.

KeywordsCell segmentationCell trackingAggregating cellLocal graphTime-series images