LY333531对高糖高脂下系膜细胞分泌细胞外基质的影响

何笑云，欧春麟，肖艳华，周素娴*

(1. 桂林医学院 附属医院内分泌科，广西 桂林 541001；2. 中南大学 肿瘤研究所，湖南 长沙 410078)



LY333531对高糖高脂下系膜细胞分泌细胞外基质的影响

何笑云1，欧春麟2，肖艳华1，周素娴1*

(1. 桂林医学院 附属医院内分泌科，广西 桂林 541001；2. 中南大学 肿瘤研究所，湖南 长沙 410078)

摘要:探讨PKCβ抑制剂(LY333531)对高糖高脂环境下系膜细胞分泌细胞外基质(ECM)的影响，单独培养人肾小球系膜细胞，实验分为对照组、LY333531组、高糖高脂组、高糖高脂+LY333531组.首先采用qRT-PCR检测PKCβI的表达，然后通过ELISA法检测细胞上清液Col IV、Fn的含量.结果显示，高糖高脂组相较于对照组，PKCβI mRNA的表达水平明显增加(P <0.05)，LY333531可以明显抑制PKCβI的表达(P <0.05)；高糖高脂组相较于对照组，细胞上清液Col IV、Fn含量明显增加(P <0.05)，而这种作用可被LY333531所抑制(P <0.05).表明高糖高脂可通过促进系膜细胞PKCβI表达从而诱导ECM的分泌，增加肾纤维化发生的风险，而LY333531可明显抑制这种作用.

关键词:高糖高脂；系膜细胞；PKCβI；细胞外基质

糖尿病肾病(diabetic nephropathy，简称DN)是导致糖尿病患者终末期肾衰竭的主要原因，其临床发病率占糖尿病(diabetes mellitus, 简称DM)患者的20%～40%[1]，常具有进行性肾间质纤维化的特征.前期研究发现，高糖高脂与DN的发生发展密切相关[2]，高糖高脂可以对肾小球系膜细胞分泌细胞外基质(extracellular matrix, 简称ECM )产生影响[3].PKCβI是蛋白激酶C (protein kinase C, 简称PKC) 家族中的一个亚型，参与细胞增殖、分化、凋亡、血管生成等多种信号传导过程[4].近年来的研究发现，PKC在DN的发病机制中起着重要作用[5-6]，大量研究表明糖尿病肾脏PKC被异常活化，PKCβI活性明显增加, 并与纤维连接蛋白(fibronectin, 简称Fn)、Ⅳ型胶原(collagen Ⅳ, Col Ⅳ)等细胞外基质(extracellular matrix, 简称ECM)蛋白增加相关[7-8].然而，在DN发生过程中，高糖高脂与PKCβI的关系尚未见报道.因此，笔者通过探讨高糖高脂环境与ECM及PKCβI三者的关系，进一步揭示DN的发病机制.

1材料和方法

1.1材料

胎牛血清(fetal bovine serum, 简称FBS)(批号: 10099-141；规格：500 mL)购买于Gibco公司；逆转录试剂盒(reverse transcription system) (批号: A3500；规格：100次)购于 Promega公司；SYBR®Premix Ex TaqTMII (批号: RR820A；规格：200次)购于TaKaRa公司；D-葡萄糖(D-glucose, 简称D-GS) (批号: 0219402483；规格：250 g)购于Biomol公司、溶血卵磷脂(lysophosphatidylcholine, 简称LPC)(批号: 38-0101-7；规格：25 mg)购于Sigma公司；PKCβ抑制剂 (LY333531) (批号: ALX-270-348-M001；规格：1 mg)购于Alexis公司；Col IV(批号: F2742-A；规格：96T)和Fn(批号: F15612-A；规格：96T)的ELISA试剂盒购于晶美生物公司.

LPC的配制：称取LPC 5 mg溶于50 mL DMEM低糖培养液中(平均功率20 W，超声溶解0.5 h)，配制成浓度为100 mg·L-1的母液，以0.22 μm混合纤维素微孔滤膜正压过滤除菌后-20 ℃保存备用.实验时以4 mL母液加入20 mL的DMEM(低糖型)培养基中，配制成浓度为20 mg·L-1的工作液.

1.2实验方法

1.2.1细胞培养与分组

人肾小球系膜细胞(human mesangial cells，简称HMCs)由东南大学附属中大医院馈赠[2-3]，所用培养液为含10%胎牛血清的DMEM培养基，细胞保持在37 ℃含有5%CO2的潮湿环境中.实验过程共分为4组：①对照组(5.5 mM D-GS)[3, 9]；②LY333531组(2×10-7M LY333531)；③高糖高脂组(30 mM D-GS + 20 mg·L-1LPC)；④高糖高脂+ LY333531组(30 mM D-GS+20 mg·L-1LPC+2×10-7M LY333531).

1.2.2ELISA法检测细胞上清中Col IV和Fn的含量

收集细胞上清液，参照ELISA试剂盒说明书分别测定各组IV型胶原(Col IV )与纤维连接蛋白(Fn)的含量，各组设置3个复孔.

1.2.3qRT-PCR检测PKCβI mRNA表达水平

采用TRIzol法提取各组细胞的总RNA，反转录得到cDNA，进行qRT-PCR检测.引物序列如下：Human PKCβI mRNA的正向引物为5’- GGGGGCGACCTCATGTAT -3’，反向引物为5’- GCAATTTCTGCAGCGTAAAA -3’；Human GAPDH mRNA的正向引物为5’- ACACCCACTCCTCCACCTTT -3’，反向引物为5’- TTACTCCTTGGAGGCCATGT-3’，引物根据GenBank序列，用软件Primer Premier 5.0 和 Oligo 6.22 设计，由华大基因生物科技有限公司合成.PCR反应条件为95 ℃ 5 min，随后为95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s重复40个循环，所有步骤均重复3次.采用2-△△Ct法分析目的基因的相对表达量.

1.2.4统计方法

2结果

2.1高脂高糖环境对系膜细胞PKCβI mRNA表达的影响

与对照组相比，高糖高脂组系膜细胞的PKCβI mRNA表达水平明显上调(P<0.05)，而高糖高脂+LY333531组相对于高糖高脂组系膜细胞的PKCβI mRNA表达水平明显受到抑制(P<0.05)(表1和图1).

表1　高糖高脂对系膜细胞PKCβI mRNA表达的影响

注：*P<0.05, 与对照组比较；#P<0.05，与高糖高脂组比较.

图1　RT-PCR检测PKCβI mRNA的表达Fig.1　Detection the level of PKCβI mRNA by RT-PCR

2.2高脂高糖环境下系膜细胞ECM的分泌

收集实验各组的细胞上清液进行ELISA法检测发现，与对照组相比，高糖高脂组系膜细胞的细胞上清液Col IV、Fn含量均升高(P<0.05)(表2).

与高糖高脂组比较，高糖高脂+ LY333531组的细胞上清液Col IV、Fn含量明显受到抑制(P<0.05)(表2).可见，LY333531可以抑制高糖高脂刺激引起的ECM相关因子的分泌.

表2　LY333531对高糖高脂下系膜细胞Col IV、Fn的影响

注：*P<0.05,与对照组比较；#P<0.05，与高糖高脂组比较.

3讨论

近年来，随着人们生活方式和饮食结构的变化, 糖尿病(DM)已成为严重威胁我国公共卫生安全的主要问题[10].糖尿病肾病(DN)作为DM的微血管并发症之一，与终末期肾脏病( end-stage renal disease，简称ESRD) 存在密切联系[11]，约36.39%的终末期肾衰竭患者与DN有关[12].DN的发生发展与多个病理改变相关，如细胞外基质( ECM) 积聚、系膜区的扩张和基底膜的增厚等[13].ECM 产生是DN发生的关键[14]，其中Col Ⅳ和Fn是构成ECM 的重要成分，Col Ⅳ和Fn的过多沉积是诱发各种慢性肾脏疾病(如肾脏进展性纤维化)的病理基础.糖、脂代谢紊乱与DN的发生发展密切相关，这与高糖、高脂对肾脏固有细胞(如肾小球毛细血管内皮细胞( GEnC) 、肾小球系膜细胞、足细胞等)的影响有关[15].高糖高脂与系膜细胞ECM分泌密切相关[16].李宏光等[17]研究报道，高糖高脂饮食能够促进新西兰兔(Oryctolagus cuniculus) 表达Col Ⅳ和Fn等分子，改变其肾小管、间质的结构和功能，促进肾小管间质的纤维化；罗霞等[18]发现高糖高脂饮食加小剂量链脲佐菌素(streptozocin, 简称STZ)诱导大鼠糖尿病模型中，与肾小球系膜基质增生相关的指标如Col Ⅳ和Fn等发生明显改变.笔者的研究发现，高糖高脂组相对于正常对照组，能刺激系膜细胞Col IV、Fn蛋白的分泌(P<0.05)，增加系膜细胞纤维化的风险，这进一步支持高糖高脂是DN的独立危险因素的观念.

PKC是一类广泛分布于哺乳动物的各种组织细胞胞浆内调控多条信号通路的丝/苏氨酸蛋白激酶.近年来发现，PKC 信号通路激活可明显影响血流动力学和血管通透性，并能引起ECM沉积[19]，抑制 PKC的活性可以延缓或阻止 DN 的发生[20-22].PKCβⅠ/Ⅱ作为PKC的重要亚型，与DN患者的肾病病症密切相关.Meier 等[7]和Menne等[8]研究报道，敲除PKCβI基因后可明显抑制高糖诱导的转化生长因子-β1(Transforming growth factor-β1, 简称TGF-β1)的表达从而减少ECM相关因子Col Ⅳ和Fn等的分泌，从而改善糖尿病肾病小鼠的肾脏体积增大及肾纤维化；此外，Soetikno等[23]发现高糖可诱导的STZ糖尿病大鼠模型PKCβI激活而导致血管内皮生长因子( vascular endothelial growth factor，简称VEGF)的表达增加，引起肾小球毛细血管异常增殖，增加DN发生的风险. LY333531是一种PKC-β的特异性抑制剂, 目前已被美国FDA 批准[24].雷少青等[20]研究发现，LY333531 可以明显改善糖尿病心肌舒张功能；此外，Kelly等[21]研究表明，LY333531能通过抑制PKC的表达以改善STZ糖尿病肾病大鼠的蛋白尿及病理变化；Koya 等[22]发现LY333531能够明显缓解db /db 小鼠( 自发型2 型糖尿病小鼠模型)出现的肾小球系膜细胞扩张、尿蛋白排泄率增加等病理变化.笔者研究发现，在高糖高脂的刺激下，系膜细胞PKCβI mRNA的表达较对照组显著增高(P<0.05)，并且细胞上清液的Col IV、Fn含量也显著增高(P<0.05).用LY333531处理后，可明显降低高糖高脂刺激引起的人肾小球系膜细胞诱导的Col IV、Fn分泌(P<0.05).由此，可以推测高糖高脂刺激引起的系膜细胞ECM分泌可能通过PKCβI介导.

综上所述，高糖合并脂代谢紊乱的情况下，可通过PKCβI的介导作用促进系膜细胞ECM相关因子(Col IV、Fn)的分泌，诱发肾小球的纤维化，增加DN发生的可能，而PKC-β抑制剂(LY333531)可明显抑制高糖高脂引起的危险因素.通过寻找适合人体的PKCβI抑制剂，可为DN的治疗提供潜在的策略.

参考文献：

[1]施进宝. 早期糖尿病肾病的研究进展[J]. 中国中医药现代远程教育, 2012 (1): 155-158.

[2]周素娴， 彭鹰， 于健， 等. 细胞相互作用对PAF、系膜细胞paf-R基因表达的影响及阿托伐他汀的干预作用[J]. 四川生理科学杂志, 2014 (2): 55-57.

[3]周素娴， 雷闽湘， 赵晋晋， 等. 高糖高脂对系膜细胞产生细胞外基质及PAF的影响[J]. 中国病理生理杂志, 2009 (10): 2056-2057.

[4]AL-KHODOR S, ABU K Y. Triggering ras signalling by intracellular francisella tularensis through recruitment of PKCalpha and betaI to the SOS2/GrB2complex is essential for bacterial proliferation in the cytosol[J]. Cell Microbiol, 2010, 12 (11): 1604-1621.

[5]NOH H, KING G L. The role of protein kinase C activation in diabetic nephropathy[J]. Kidney Int Suppl, 2007 (106):S49-S53.

[6]BRYANT D M, ROIGNOT J, DATTA A, et al. A molecular switch for the orientation of epithelial cell polarization[J]. Dev Cell, 2014, 31(2):171-187.

[7]MEIER M, PARK J K, OVERHEU D, et al. Deletion of protein kinase C-beta isoform in vivo reduces renal hypertrophy but not albuminuria in the streptozotocin-induced diabetic mouse model[J]. Diabetes, 2007, 56(2):346-354.

[8]MENNE J, SHUSHAKOVA N, BARTELS J, et al. Dual inhibition of classical protein kinase C-alpha and protein kinase C-beta isoforms protects against experimental murine diabetic nephropathy[J]. Diabetes, 2013, 62 (4): 1167-1174.

[9]周素娴，雷闽湘，赵晋晋. D-葡萄糖对系膜细胞产生细胞外基质的时效与量效研究[J]. 广西医学, 2009 (8): 1072-1073.

[10]DUAN J G, CHEN X Y, WANG L, et al. Sex differences in epidemiology and risk factors of acute coronary syndrome in Chinese patients with type 2 diabetes: a long-term prospective cohort study[J]. PLoS One, 2015, 10 (4): e122031.

[11]张倩， 石蒙， 檀金川. TGF-β_1与糖尿病肾病的关系及中医药研究进展[J]. 中国中西医结合肾病杂志, 2014 (11): 1030-1032.

[12]赵玲， 张园. 糖尿病肾病中医证候研究进展[J]. 中国中医药现代远程教育, 2010 (7): 199-200.

[13]吕高虹， 许惠琴. 肾系膜细胞与糖尿病肾病变的相关性研究[J]. 辽宁中医药大学学报, 2011 (12): 48-50.

[14]ROSSERT J, TERRAZ-DURASNEL C, BRIDEAU G. Growth factors, cytokines, and renal fibrosis during the course of diabetic nephropathy[J]. Diabetes Metab, 2000, 26 (Suppl 4): 16-24.

[15]周素娴. 高糖高脂对肾小球细胞影响的研究进展[J]. 新医学, 2014 (5): 286-289.

[16]吕高虹， 许惠琴， 秦佩佩， 等. 高糖对人肾小球系膜细胞增殖及细胞外基质的影响[J]. 中国老年学杂志, 2013 (5): 1066-1067.

[17]李宏光， 蔡元菊， 邹锦慧， 等. 高糖高脂饮食对兔肾小管间质纤维化的影响[J]. 动物学杂志, 2010 (1): 145-150.

[18]罗霞， 邓玲艳， 许文娟， 等. 腺苷酸活化蛋白激酶通过抑制mTOR信号通路缓解糖尿病大鼠肾脏细胞外基质沉积[J]. 华中科技大学学报(医学版), 2015 (1): 10-15.

[19]GERALDES P, KING G L. Activation of protein kinase C isoforms and its impact on diabetic complications[J]. Circ Res, 2010, 106 (8): 1319-1331.

[20]雷少青， 苏娃婷， 徐金金， 等. PKC-β抑制剂LY333531对糖尿病大鼠心肌功能及Caveolins蛋白的影响[J]. 临床和实验医学杂志, 2014 (16): 1305-1308.

[21]KELLY D J, ZHANG Y, HEPPER C, et al. Protein kinase C beta inhibition attenuates the progression of experimental diabetic nephropathy in the presence of continued hypertension[J]. Diabetes, 2003, 52 (2): 512-518.

[22]KOYA D, HANEDA M, NAKAGAWA H, et al. Amelioration of accelerated diabetic mesangial expansion by treatment with a PKC beta inhibitor in diabetic db/db mice, a rodent model for type 2 diabetes[J]. FASEB J, 2000, 14 (3): 439-447.

[23]SOETIKNO V, WATANABE K, SARI F R, et al. Curcumin attenuates diabetic nephropathy by inhibiting PKC-alpha and PKC-beta1 activity in streptozotocin-induced type I diabetic rats[J]. Mol Nutr Food Res, 2011, 55 (11): 1655-1665.

[24]SCHWARTZ S G, FLYNN H J, AIELLO L P. Ruboxistaurin mesilate hydrate for diabetic retinopathy[J]. Drugs Today (Barc), 2009, 45 (4): 269-274.

(责任编辑于敏)

doi:10.3969/j.issn.1000-2162.2016.04.014

收稿日期：2015-09-01

基金项目:国家自然科学基金资助项目(81260134,81560148);广西科技厅青年基金资助项目(2011GXNSFB018108)

作者简介：何笑云(1990-)，女，湖南郴州人，桂林医学院硕士研究生；*周素娴(通信作者)，桂林医学院主任医师，硕士生导师，E-mail：zoe_doctor@163.com.

中图分类号：R692.6

文献标志码:A

文章编号:1000-2162(2016)04-0087-05

Effect of LY333531 on the expression of extracellular matrix in mesangial cells exposed to high glucose and lysophosphatidylcholine

HE Xiaoyun1, OU Chunlin2, XIAO Yanhua1， ZHOU Suxian1*

(1. Department of Endocrinology, Affiliated Hospital, Guilin Medical University, Guilin 541001, China;2. Cancer Research Institute, Central South University, Changsha 410078, China)

Abstract:To investigate the effect of PKCβ inhibitor (LY333531) on extracellular matrix (ECM) of masangial cells in high glucose (HG) and lysophosphatidylcholine (LPC) environment, human mesangial cells (HMCs) were cultured alone and divided into 4 groups: control; LY333531; HG and LPC(HG+LPC); HG, LPC and LY333531(HG+LPC+LY333531). First, we used the method of quantitative real-time PCR(qRT-PCR) to detect the expression of PKCβI; then, the levels of collagen IV and fibronectin were detected by enzyme linked immunosorbent assay(ELISA) in the supernatant. These results suggested that the mRNA expression of PKCβI in the group of HG+LPC was higher than the control group (P<0.05), and the effect could be obviously inhibited by LY333531 (P<0.05). Meanwhile, compared with the control group, the level of collagen IV and fibronectin in the supernatant was significantly increased in the group of HG+LPC (P <0.05), and the effect could be also inhibited by LY333531 notably (P<0.05). Therefore, we could conclude that the HG+LPC can aggrandize the secretion of ECM by increasing the expression of PKCβI in mesangial cells, which can increase the risk of renal fibrosis, however, LY333531 can weaken the effect obviously.

Keywords:high glucose and lysophosphatidylcholine; mesangial cells; protein kinase C βI (PKCβI); extracellular matrix (ECM)