酿酒酵母生物合成胞磷胆碱的条件优化

易凤炎，　陈燕妮，　邱蔚然，　周长林*

1. 中国药科大学生命科学与技术学院， 江苏 南京 210009；2. 南通秋之友生物科技有限公司, 江苏 南通 226200



酿酒酵母生物合成胞磷胆碱的条件优化

易凤炎1,2，陈燕妮1，邱蔚然2，周长林1*

1. 中国药科大学生命科学与技术学院， 江苏 南京 210009；2. 南通秋之友生物科技有限公司, 江苏 南通 226200

摘要：通过优化胞磷胆碱底物浓度的发酵条件，提高酿酒酵母发酵菌浓及胞磷胆碱转化率。 分别以胞苷酸、磷酸胆碱、硫酸镁和乙醇等底物和反应关联物质诱导酿酒酵母，采用单因素变量实验优化发酵条件。 优化后，酿酒酵母C401菌株摇瓶培养的菌浓为70 g/L，胞磷胆碱转化率为53.3%，比诱导前提高了33.5%。30 L发酵中菌浓可达90.5 g/L，胞磷胆碱转化率为59%。

关键词：酿酒酵母； 胞磷胆碱； 底物诱导； 发酵

胞磷胆碱(CDPC)全称胞苷-5′-二磷酸胆碱，属于核酸类生化药物。它是治疗脑意识障碍的首选药物[1]，对于脑外伤引起的脑昏迷、脑卒中后遗症的功能恢复及老年痴呆等病症都有独特的疗效，具有极好的应用前景。20世纪50年代，Kennedy博士等人[2]发现并确定胞磷胆碱钠分子结构，稍后Rosseter等[3]阐明其功能。中国自20世纪70年代研究了利用酵母细胞生产胞磷胆碱的方法[4]，牛红星[5]等利用固定化技术生产胞磷胆碱的方法，顾复昌[6]等利用啤酒酵母生物合成胞磷胆碱的方法，宋丽芳[7]等利用东方伊萨酵母生物合成胞磷胆碱的方法。

本实验以酿酒酵母CGMCC2.603为出发菌种，分别利用胞苷酸、磷酸胆碱、硫酸镁和乙醇等底物和反应相关物质诱导筛选出C401菌种，经优化培养基配方，30L发酵罐单因素变量实验，提高了C401的菌浓，并通过发酵后处理提高了CDPC摩尔转化率(以下简称转化率)，实验结果可应用于产业化生产。

1材料与方法

1.1实验材料

1.1.1菌种

酿酒酵母CGMCC2.603，中国微生物菌种保藏中心。

1.1.2培养基

斜面培养基(%)：酵母浸膏0.5，蛋白胨1，葡萄糖1，琼脂粉2，pH自然，0.8×105Pa灭菌20 min。

揺瓶和发酵培养基(%)：葡萄糖4，酵母浸膏4，(NH3)2HPO43，pH 5.0。摇瓶培养基0.8×105Pa灭菌20 min，发酵培养基90 ℃消毒20 min。

1.2实验方法

1.2.1生物合成胞磷胆碱的酿酒酵母筛选方法

取斜面培养菌体2环接入装有50 mL含有胞苷酸、磷酸胆碱、硫酸镁和乙醇等诱导物的摇瓶培养基，培养24 h，将其转接装有400 mL含有胞苷酸、磷酸胆碱、硫酸镁和乙醇的发酵培养基，培养24 h，经离心处理收集菌体，-40 ℃冻存25 d，测定酿酒酵母生物合成CDPC的转化率。

1.2.2菌浓测定方法

用5 mL移液管移取4 mL待测菌液置入质量为m0的空EP管中，12 000 r/min离心4 min，弃去上清液，称重即为m1，则菌浓为(m1-m0)×1 000/4 g/L。

1.2.3CDPC转化率测定方法

在200 mL、pH 6.5含有30 mmol/L胞苷酸、21 mmol/L磷酸胆碱、25 mmol/L葡萄糖和27 mmol/L硫酸镁等反应液中加入冻存菌体46 g，33 ℃，150 r/min反应2.5 h，补葡萄糖3.4 g，继续反应，4.0 h取样。12 000 r/min离心4 min，取上清液10 μL在琼脂糖凝胶板点样，电泳5 min，切取CDPC条带加入0.01 mol/L盐酸溶液5 mL，沸水浴5 min测定A280nm，利用CDPC琼脂糖电泳测定的标准曲线计算转化率[8]。

1.2.4菌种发酵方法

种子液以5%接种量接种于30 L发酵罐中培养，通气量为0.55 m3/h，pH维持在4.0以上，分别改变搅拌桨组合和位置、装液量、搅拌速度和接种种龄，发酵11 h，经抽滤处理收集菌体，-18 ℃冻存7 d ～10 d，测定CDPC的转化率。

1.2.5残糖测定方法

DNS法测定发酵液中残糖浓度[9]。

2结果

2.1生物合成胞磷胆碱的酿酒酵母诱导物优化

在揺瓶培养基中加入不同浓度的胞苷酸进行底物诱导，由图1(A)可知，当胞苷酸在低浓度时，随着其浓度增加，诱导作用明显提高，但其浓度达到10 mmol/L以上时，其诱导作用反而降低，这一现象与该反应在CMP一定浓度后存在底物抑制是相符的，故通过CMP底物诱导提高CDPC转化率必须在较低浓度下才有效，以CMP 10 mmol/L为最佳浓度诱导时，其CDPC转化率可从19.9%提高到53.3%。在揺瓶培养基中加入不同浓度的磷酸胆碱进行底物诱导，由图1(B)可知，磷酸胆碱浓度10 mmol/L时诱导效果最佳，CDPC转化率从19.9%提高到31.2%。在揺瓶培养基中加入不同浓度的硫酸镁诱导，由图1(C)可知，硫酸镁浓度12g/L时，CDPC转化率可从19.9%提高到23.7%。在揺瓶培养基加入不同浓度的乙醇诱导，由图1(D)可知，随着乙醇浓度增加，CDPC转化率基本呈下降趋势，说明乙醇有阻遏作用。

图1　生物合成胞磷胆碱的酿酒酵母诱导物优化

2.2摇瓶培养基优化

在酵母浸膏1%～4%，糖蜜1%～5%，磷酸氢二铵0.1%～0.3%的条件下，按六西格玛DOE(Design Of Experiment，实验设计)表格设计实验，用minitab 15软件对菌浓响应分析，结果见表1。从表1可知，最佳培养基配方(%)：糖蜜5，酵母浸膏4，磷酸氢二铵0.3，pH 5.0。若用葡萄糖代替糖蜜，结果如表2，培养基配方(%)：葡萄糖4，酵母浸膏4，磷酸氢二铵0.3，pH 5.0。在培养基中加入不同量的生物素，结果如图2。此时生物素的添加，对于菌浓无明显提升，因此在培养基中不需添加生物素。经上述摇瓶培养基优化，C401菌种摇瓶培养菌浓为70 g/L，发酵培养基也沿用此配方。

表1　培养基优化的DOE实验表

表2　用葡萄糖代替糖蜜的培养基表

图2　生物素量对菌浓的影响

2.3摇瓶培养时间对菌浓和CDPC转化率的影响

将50 mL揺瓶菌液接种到400 mL揺瓶培养基中，28 ℃、150 r/min培养，每4 h取样测定菌浓，培养48 h，结果如图3(A)，培养8 h进入对数生长期，24 h进入稳定期，菌浓为70 g/L，培养至48 h菌浓为81 g/L。分别取不同培养时间菌体测定CDPC转化率，结果如图3(B)，当培养时间较短时，随着培养时间延长，CDPC转化率明显提高，但其时间达到24 h以上时，CDPC转化率反而降低，培养24 h的菌体CDPC转化率最高，可达53%。

图3　培养时间对菌浓和CDPC转化率的影响

2.430 L罐的发酵研究

2.4.1装液量、搅拌速度、搅拌桨不同间距对气液分散状态的影响

在30 L罐(示意图如图4)上配置三层搅拌桨，其中上层桨和底桨为六平叶Rushton涡轮径向流桨，中层桨为四斜叶开启涡轮轴向流桨，三层桨桨径均为D=0.4T，底桨离底距离C1，上层桨离液面距离△H，中层桨离底桨距离C2。搅拌桨不同组合间距如表4所示，在搅拌桨间距为组合1时，以清水为工作介质，搅拌转速在300 r/min以上，常温下操作，装液量18 L～20 L时呈载气状态，装液量不在此范围呈气泛状态。在搅拌桨间距为组合2时，以清水为工作介质，搅拌转速在250 r/min以上，常温下操作，装液量17 L～21 L时呈载气状态。通过上述实验，组合2比组合1更好。

图4　30 L罐示意图

表3　搅拌桨不同间距组合方式

2.4.2发酵研究

在搅拌桨间距为组合2，接种量为5%的条件下，研究了不同搅拌转速、装液量和接种种龄对菌浓的影响。搅拌转速如图5(A)所示，400 r/min 的溶氧(DO)较好，菌浓最高达36 g/L。装液量如图5(B)所示，装液量20 L的DO较好，在2.4.1所述的17 L～21 L载气状态范围内，与15 L气泛状态相比，18 L、20 L装液量发酵状态的DO均高于15 L装液量发酵状态的DO。在17 L～21 L载气状态时，18 L要优于20 L，此时菌浓可达40 g/L。接种种龄如图5(C)所示，接种种龄为26 h较好，此时比生长速率大，菌浓可达41 g/L。

由2.4节实验确定30 L罐发酵最优条件为：在搅拌桨间距为组合2，接种量为5%的条件下，搅拌转速为400 r/min，装液量为18 L，接种种龄为26 h。

2.530 L罐补糖发酵

在2.4最优发酵条件下虽参照文献[10]进行葡萄糖流加实验，结果如图6所示，方案1，起始葡萄糖浓度为20 g/L，残糖浓度低于10 g/L时流加葡萄糖，菌浓可达42 g/L，与未补糖发酵比较菌浓无明显提高。方案2，起始葡萄糖浓度减为10 g/L，残糖浓度低于8 g/L时流加葡萄糖，菌浓可达68 g/L。方案3，起始葡萄糖浓度为10 g/L，残糖浓度低于5 g/L时流加葡萄糖，菌浓可达90 g/L。由上述实验可知，起始葡萄糖10 g/L，残糖浓度低于5 g/L时补糖效果最好。

2.6发酵后处理

据文献报道[11]无氧状态下酶系比有氧状态下酶系更利于生物合成CDPC，因此发酵后抽滤收集菌体，分别用2%葡萄糖溶液低温浸泡不同时间。由图7可知，随着菌体浸泡时间从0 d增加到4 d，CDPC转化率先增后减，其中菌体浸泡2 d时，CDPC转化率最高为59%，比未浸泡组提高了6%。

图5　发酵研究图

3讨论

经10 mmol/L胞苷酸诱导筛选菌种C104，在葡萄糖4%、酵母浸膏4%、磷酸氢二铵0.3%、pH 5.0条件下，C104摇瓶菌浓可达70 g/L，底物转化CDPC的转化率为53.3%，比出发株提高了33.5%。在接种种龄26 h，装液量18 L，搅拌速度400 r/min，三层搅拌桨间距0.55 T，下层搅拌桨到搅拌釜底距离0.36 T的条件下，30 L发酵液呈载气状态，流加葡萄糖发酵，菌浓可达90.5 g/L，发酵后将菌体用2%葡萄糖溶液低温浸泡2 d，CDPC转化率为59%。以上实验结果已可应用于CDPC产业化生产，下阶段任务将进一步优化CDPC反应条件，进一步提高其转化率。

图6　30 L补糖发酵进程曲线

图7　30 L发酵后处理

参考文献

[1]Secades JJ, Frontera G. CDP-choline: pharmacological and clinical review [J]. Meth Find Exp Clin Pharm. 1995, 17(Suppl B):1-54.

[2]Kennedy EP, Weiss SB. Cytidine diphosphate choline: a new intermediate in lecithin biosynthesis1 [J]. Journal of the American Chemical Society, 1955, 77(1):250-251.

[3]Rossiter RI, McLeod IM, Strickland KP. Biosynthesis of lecithin in brain and degeneration nerve participation of cytidine diphosphate choline[J]. Canadian Journal of Biochemistry and Physiology, 1957, 35(11):945-951.

[4]王永智, 尉亚辉, 聂利芳. 胞磷胆碱生物合成与化学合成的比较与展望[J]. 西北药学杂志, 2009, 24(3):235-236.

[5]牛红星, 邱蔚然, 丁庆豹. 用固定化啤酒酵母细胞合成胞嘧啶核苷二磷酸胆碱[J]. 华东理工大学学报, 2002, 28(8):372-375.

[6]顾复昌, 杨亮懿. 胞二磷胆碱的生产[J]. 发酵科技通讯, 2007, 36(1): 9-11.

[7]宋丽芳, 尤翠萍, 陶冠军等. 东方伊萨酵母生物转化法制备胞二磷胆碱[J]. 食品与生物技术学报, 2015, 34(2): 201-208.

[8]邱蔚然, 王育. 胞苷二磷酸胆碱的简易快速测定法[J]. 中国医药工业杂志, 1985, 16(2): 23-25.

[9]陈长华. 发酵工程实验[M]. 北京: 高等教育出版社, 2009: 187-188.

[10]王颖, 何宁, 李清彪等. 酿酒酵母S.cerevisiae高密度培养条件优化研究[J]. 工业微生物, 2007,37(1): 34-38.

[11]邱蔚然, 丁庆豹. 核酸类产品的生物合成[M].上海: 华东理工大学出版社, 2006: 80-82.

doi:10.3969 /j.issn.1001-6678.2016.03.007

基金项目：江苏省科技成果转化专项资金资助项目(NO.BA2012090)。

作者简介：易凤炎(1992～)，女，硕士在读生。E-mail：yifengyan@yeah.net。 E-mail:cl_zhou@cpu.edu.cn。

*通讯作者：周长林(1964～)，男，教授，博士生导师，研究领域为微生物代谢调控和药物生物合成。电话：025-83271323，

Optimization of fermentation conditions for citicoline biosynthesis bySaccharomycescerevisiae

YI Feng-yan1,2, CHEN Yan-ni1, QIU Wei-ran2, ZHOU Chang-lin1

1. School of Life Science and Technology, China Pharmaceutical University, Nanjing 210009, China;2. Nantong QZU Bioscience & Biotechnology Co. Ltd, Nantong 226200, China

AbstractIn order to increase fermentative cell concentration of Saccharemyces cerevisiae and to improve citicoline conversion rate, the substrates and fermentation conditions were optimized. Saccharomyces cerevisiae cells was induced by substrates and related reactants such as cylidylicacid(CMP), choline phosphate, magnesium sulfate and ethanol, respectively and the fermentation conditions were optimized by single factor variable experimental tests. The results showed that after optimization, the cell concentration of Saccharomyces cerevisiae C401 reached 70 g/L in the shake flask cultures, which was 33.5% higher than before. In 30 L fermentation test, the cell concentration was up to 90.5 g/L and the citicoline conversion rate reached 59%, respectively.

Key wordsSaccharomyces cerevisiae; citicoline; substrate induction; fermentation