结核分枝杆菌融合抗原38kD-Rv1419、16kD-Rv2041c在结核病血清学诊断中的应用价值*

郭洪娜

(临沂市沂水中心医院，山东 沂水　276400)



结核分枝杆菌融合抗原38kD-Rv1419、16kD-Rv2041c在结核病血清学诊断中的应用价值*

郭洪娜

(临沂市沂水中心医院，山东 沂水276400)

摘要：目的探讨结核分枝杆菌融合抗原38kD-Rv1419、16kD-Rv2041c在结核病血清学中的诊断价值。方法以痰涂片、痰培养和标准试剂盒作为对照，应用化学发光法(chemiluminescence immunoassay，CLEIA)检测结核病组、非结核呼吸系病组、健康对照组血清标本中38kD- Rv1419、16kD- Rv2041c的抗体水平，评价其在结核病血清学中的诊断价值。结果①肺结核病组38kD-Rv1419、16kD-Rv2041c的抗体水平(143621.0±23231.7，179731.1±16342.1)明显高于非结核呼吸疾病组(27417.5±2371.8，32066.2±3310.9)和健康对照组(35262.9±5764.2，22765.5±3695.7)，(P<0.05)。②38kD-Rv1419、16kD-Rv2041c检测抗结核抗体的敏感度(69.0%，72.0%)、高于痰培养(21.0%)、38 kD(20.0%)、16 kD试剂盒(26.0%)，(P<0.05)。③38kD- Rv1419、16kD- Rv2041c检测抗结核抗体的特异度(85.4%，83.8%)高于38kD(61.1%)、16kD试剂盒(50.0%)，(P<0.05)。④联合应用38kD- Rv1419、16kD- Rv2041c融合抗原检测抗结核抗体的敏感度为89.0%，明显高于38kD- Rv1419(69.0%)、16kD- Rv2041c(72.0%)，(P<0.05)。结论结核分枝杆菌融合抗原38kD- Rv1419、16kD- Rv2041c在结核病的血清学诊断上均具有较高的敏感度和特异度，其联合应用，能够提高抗结核抗体检测的敏感度。

关键词：38kD-Rv1491；16kD-Rv2041c；化学发光酶免疫法；血清学诊断

目前世界上现存的传染病中，结核病(tuberculosis，TB)的传播流行是非常广泛、严重的，并且严重危害着人民群众的身体健康，导致罹患传染病的人群致残、致死[1]。目前结核病实验室诊断的主要方法有细菌学、血清学、分子生物学等，其中血清学诊断因所需的费用低、实验方法简单而占有重要的地位，但也有不足之处：特异性抗体的检测敏感度不高，一种抗原只能检出部分结核感染者，用单个抗原进行检测，其结果远不能满足临床工作的需求等。所以多个抗原融合或者联合应用就成了今后血清学诊断的主要研究方向。在本研究中应用化学发光酶免疫法检测230份血清标本中抗38kD-Rv1419、16kD-Rv2041c的抗体水平，为结核病血清学诊断提供更好的抗原选择。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1研究对象(1)肺结核病组：2012年9月至2015年4月在沂水中心医院传染病科治疗的100例患者，全部按照结核病诊断标准[2]确诊为肺结核，其中52例男性，48例女性，平均年龄为(42±12)岁。(2)非结核呼吸疾病组：同期在呼吸内科治疗的90例非结核呼吸疾病患者，排除肺结核，46例男性，44例女性，平均年龄(38±20)岁。(3)健康对照组：40例健康体检者均来源于同期在体检中心查体的人员，无结核病感染史，无呼吸道疾病。22例男性，18例女性，平均年龄为(39±15)岁。

1.1.2主要试剂与仪器38kD- Rv1419、16kD- Rv2041c抗原购自军事医学科学院；16kD、38kD、16kD+38kD结核分枝杆菌抗体检测试剂盒分别购自于广州建仑、南京大渊、上海奥普生物医药有限责任公司；化学发光仪为北京科美东雅发展有限公司；BACTEC MGIT 960全自动分枝杆菌培养仪为BD公司。

1.2方法

1.2.1痰涂片和痰培养严格按《结核病诊断实验室检验规程》进行操作。

1.2.2用38kD、38kD+16kD、16kD试剂盒(胶体金法)检测肺结核病组、非结核呼吸疾病组血清标本中的抗结核抗体，严格按照试剂说明书操作。

1.2.3抗38kD- Rv1419、16kD- Rv2041c的抗体水平检测(1)包被抗原：用抗原包被液将38kD- Rv1419、16kD- Rv2041c分别稀释至12.5、6.25μg/ml，每孔加样100 μl，留空白对照孔(只加抗原包被液)，振荡混匀，置4℃过夜。(2)洗板： 5次，每次5min。(3)封闭：每孔加150 μl封闭液混匀，37℃温育60 min；(4)洗板： 5次，每次5min。(5)加待检样品：每孔加100 μl用封闭液按1∶20稀释的血清标本，混匀，37℃温育60 min。每个样本做2个平行孔。同时设空白、阴性及阳性对照，空白孔内只加抗原包被液；阴性孔内加确诊为非结核呼吸疾病患者血清，阳性孔内加38kD- Rv1419、16kD- Rv2041c抗原阳性的血清标本。(6 )洗板：5次，每次5min。(7)加入羊抗人IgG：将HRP标记的羊抗人IgG抗体用封闭液稀释至1∶10000，混匀，每孔加样100μl，37℃温育60 min。(8)洗板：5次，每次5min。(9)加入底物液：每孔加100 μl新鲜配制的底物溶液，立即放入化学发光仪。(10)测定发光值：将反应完全的酶标板放入发光仪中，读取发光值，取两孔平均值作为最终结果。(11) 绘制受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve, ROC曲线)。

1.3敏感度与特异度的计算公式敏感度=真阳性人数/(真阳性人数+假阴性人数)×100%。特异度=真阴性人数/(真阴性人数+假阳性人数)×100%

2结果

2.1各组血清标本中38kD- Rv1419、16kD- Rv2041c的抗体水平见表1。肺结核病组38kD- Rv1419、16kD- Rv2041c的抗体水平明显高于非结核呼吸疾病组和健康对照组，P<0.05；健康对照组与非结核呼吸疾病组相比较无明显差异，P>0.05。

表1　各组血清标本中抗38kD- Rv1419，

2.238kD- Rv1419、16kD- Rv2041c抗体的ROC曲线分析见表2，图1，图2。

38kD-Rv1419抗体的ROC曲线下面积为0.842，把特异度为90%时的抗38kD- Rv1419抗体的化学发光值69000作为结核病诊断的临界值，100例肺结核病患者中69例阳性，敏感度为69.0% (69/100)；90例非结核呼吸疾病患者中13例阳性，特异度为85.6% (77/90)。40例健康者中阳性6例，特异度为85.0% (34/40)。总特异度为85.4% (111/130)。

16kD- Rv2041c抗体的ROC曲线下面积为0.857，以特异度为90%时的抗16kD- Rv2041c抗体的化学发光值49000为诊断结核病的临界值，100例肺结核病患者中，72例阳性，敏感度为72.0%(72/100)；90例非结核呼吸疾病患者中，16例阳性，特异度为82.2%(74/90)。40例健康者中5例阳性，特异度为87.5%(35/40)。总特异度为83.8%(109/130)。

表2　抗38kD- Rv1419、16kD- Rv2041c的抗体ROC曲线分析表

95%可信区间均未包含0，曲线下面积有统计学意义

图1　抗原38kD- Rv1419CLEIA检测的ROC曲线图

图2　抗原16kD- Rv2041cCLEIA检测的ROC曲线图

2.3338kD- Rv1419、16kD- Rv2041c抗体的测定和痰涂片、痰培养及38kD、38kD+16kD、16kD 试剂盒检测结果的比较，见表3。100例肺结核的患者中，38kD- Rv1419、16kD- Rv2041c检测的敏感度明显高于痰培养法、38kD试剂盒和16kD试剂盒，P<0.05；与38kD+16kD试剂盒比较差无明显异，P>0.05。90例非结核的呼吸疾病患者中，检测的特异度明显高于38kD试剂盒和16kD试剂盒，P<0.05；与38kD+16kD试剂盒比较，无明显差异，P>0.05。

2.438kD- Rv1419、16kD- Rv2041c两种抗原联合检测的临床价值见表4。将38kD-Rv1419、16kD-Rv2041c两种抗原联合进行检测，其在诊断结核病上的敏感度为89.0%(89/100)，明显高于38kD- Rv1419(69.0%，69/100)、16kD- Rv2041c(72.0%，72/100)，P<0.01。38kD- Rv1419、16kD- Rv2041c两种抗原联合进行检测的特异度为82.3%(107/130)，与38kD- Rv1419(85.4%, 111/130)、16kD- Rv2041c(83.8%, 109/130)相比，无显著差异，P>0.05。从而可以看出这两个抗原联合应用能够明显提高结核抗体检测的敏感度，而对特异度没有影响。

表3　38kD- Rv1419、16kD- Rv2041c和痰涂片、痰培养及试剂盒检测结果的比较

表4　38kD- Rv1419、16kD- Rv2041c两种抗原联合检测的临床价值

3讨论

结核病的临床诊断由于结核抗原多而复杂，所以结核病患者的抗体谱也呈现多样性。Alito等[3]用10种重组结核分枝杆菌蛋白抗原检测结核患者血清中的特异性结核抗体，结果显示近90%的患者血清中至少存在一种结核抗体，抗体在体内表达的数量、种类及水平可以随患者的免疫背景、疾病的不同阶段以及结核分枝杆菌菌株的不同而不同[4]。结核病患者的抗体反应是针对多种结核抗原的，任何一种抗原都无法检测结核病患者血清中所有的结核抗体，因此应用多种抗原进行联合检测，在保证特异性的基础上有助于提高诊断的敏感性[5]。

38kD蛋白为结核分枝杆菌特异抗原，可引起机体的体液和细胞免疫，是主要免疫原，用于结核病血清学诊断，检测的敏感度和特异度均较高，是迄今为止作为单项诊断结核最好的抗原，也是目前商品化试剂盒中使用最广泛的抗原之一。研究报道该抗原检测的敏感度为16% ～80%[6]。Rv1419是一个T细胞抗原，有较好的免疫原性，可刺激单个核细胞产生大量的IFN-γ。在本研究中我们把38 kD、Rv1419这两种蛋白进行融合，形成了新的蛋白抗原，发现其在结核病血清学诊断中的敏感度和特异度分别为69.0%、85.4%，均高于单个抗原检测，可以作为结核病血清学诊断的备选抗原之一。

很多研究表明，16kD抗原是一种不管在结核分枝杆菌稳定生长期还是在缺氧期都占优势的蛋白[7]。有关学者[8]通过研究发现16kD抗原可以在结核病发病早期就能够检测出来。有关研究报道[9-11]，应用酶联免疫吸附法检测16kD抗原在诊断结核病的敏感度为23.5%～68.1%，特异度为69.5%～89.1%，和 38kD抗原联合检测的敏感度达到49.02%～70.1%，特异度为70.3%～82.0%。Rv2041c抗原是一种分泌蛋白，分子量约为30 kD，在肺结核患者的肺部高表水平达。对渗出期肺结核患者的痰液进行检测，可以查及该蛋白升高，Rv2041c抗原可以刺激宿主发生强烈的抗原抗体反应[12]。有关研究[13]发现结核分枝杆菌的毒力越高，抗Rv2041c的抗体滴度就越高。国内学者[14]通过研究发现Rv2041c检测结核病的敏感度为30.2%～50.1%。我们把这两种蛋白融合成一个新的蛋白抗原，发现融合抗原具有较好的免疫原性，其在结核病血清学诊断中的敏感度和特异度分别为72.0%、83.8%，高于单个抗原检测，也可以作为结核病血清学诊断的备选抗原。

在100例肺结核病患者中，38kD-Rv1419、16kD-Rv2041c检测的敏感度分别为69.0%、72.0%，明显高于痰培养(21.0%)、38kD试剂盒(20.0%)、16kD试剂盒(26.0%)，P<0.01；低于38kD+16kD(74.0%)试剂盒，但无明显差异，P>0.05。38kD- Rv1419、16kD- Rv2041c抗原检测抗结核抗体的特异度分别为85.4%、83.8%，显著高于38kD试剂盒(61.1%)、16kD(50.0%)；低于38kD+16kD(88.9%)，但无显著差异，P>0.05。

对以上结果进行分析，我们可以知道结核分枝杆菌融合抗原38kD- Rv1419、16kD- Rv2041c在诊断结核方面的价值远远超过结核病的细菌学检查，并且明显较目前临床上应用比较广泛的38kD、16kD抗体试剂盒更具有优势。但仍然达不到WHO所提出的要求。

我们以ROC曲线中特异度为90%时的38kD- Rv1419、16kD- Rv2041c抗体的化学发光值为诊断结核病的界限值，将这两种结核分枝杆菌融合抗原联合应用检测抗结核抗体，我们发现其敏感度(89.0%)得到了大幅度的提高，其特异度却无明显降低(82.3%)。我们进一步分析其原因，可能是因为这两种结核分枝杆菌融合抗原含有多种结核分枝杆菌特异性抗原决定簇。

通过以上研究结果，我们可以看出结核分枝杆菌融合蛋白38kD- Rv1419、16kD- Rv2041c都有非常高的免疫原性分别将其用于结核病的血清学诊断上均具有较高的灵敏性及特异度，将这两种结核分枝杆菌融合抗原联合以后，能够较好的提高结核病诊断的阳性率，对特异度没有影响，这两种结核分枝杆菌融合蛋白可以应用到结核病的临床诊断中去。

参考文献：

[1]Global tuberculosis control key finding from the December 2011WHO report[R]. World Health Organization, 2012, 85: 69-80.

[2]中华医学会结核病学分会. 肺结核诊断和治疗指南[J]. 中国防痨杂志, 2001, 24(2): 70-74.

[3]Alito A, Me Nair J, Girvin RM. Identification of Mycobacterium bovis antigens by analysis of bovin T-cell responses after infection with a virulentstrain[J]. Braz J Med Biol Res, 2003, 36(11): 1523-1531.

[4]Gall D, Nielsen K. Comparison of some methods for determining cut-off values for serological assays：A retrospective study using the fluorescence polarization assays[J]. J Immuno Chem, 2001, 22(2): 85-98.

[5]周丽蓉. 结核病血清学诊断的新进展[J]. 中国实用内科学, 2005, 3(25): 269-271.

[6]He XY, Li J, Hao J, et al. Assessment of five antigens from Mycobacterium tuberculosis for serodiagnosis of tuberculosis[J]. Clin Vaccine Immunol, 2011, 18(4): 565-570.

[7]Yuan Y, Crane DD, Simpson RM, et al. The 16kDa alpha Crystallin(Acr) protein of Mycobacterium tuberculosis is required for growth in macrophages [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1998, 95: 9578-9583.

[8]Ricardo CT, Jorge SD, Valeria BM, et al. Cell proliferation and interferon response to recombinant MBP-3, NarL, Mt-10.3, and 16kDa Mycobacterium tuberculosis antigens in Brazilian tuberculosis patients [J]. Memlnst Oswaldo Cruz Riode Janeiro, 2006, 101(8): 857-861.

[9]吕冰, 樊学军, 刘忠华, 等. 三种结核分枝杆菌特异性重组蛋白诊断价值的初步研究[J]. 中国人兽共患病学报, 2008, 24(4): 291-292.

[10]柏文娟, 白广红, 胡忠义, 等. IgG 抗体适体与16KD抗原联合检测血清结核抗体研究[J]. 中华医师杂志(电子版), 2011, 5(23): 6986-6991.

[11]阳幼荣, 李邦印, 吴雪琼, 等. 结核分枝杆菌16KD重组蛋白的纯化及血清学诊断应用价值的研究[J]. 中国医师杂志, 2007, 9(6): 742-743.

[12]Abebe F, Holm C, Wiker HG, et al. Progress in serodiagnosis of Mycobacterium tuberculosis infection[J]. Scand J Immunol 2007, 66(21): 176-91.

[13]Kim SY, Shin AR, Kim HJ, et al. Identification of Rv2041c, a Novel Immunogenic Antigen from Mycobacterium tuberculosis with Serodiagnostic Potential[J]. Scandinavian Journal of Immunology, 2009, 70(15): 457-464.

[14]冯金栋, 阳幼荣, 吴雪琼, 等. 结核分枝杆菌Rv2041c重组蛋白在结核病诊断中的应用价值[J]. 实用医学杂志, 2012, 28(22): 3732-3735.

*作者简介：郭洪娜(1978—)，女，本科，主管技师，从事临床检验工作。

中图分类号：R446.11+2

文献标识码：A

文章编号：1004-7115(2016)07-0738-04

doi:10.3969/j.issn.1004-7115.2016.07.006

(收稿日期2016-03-07)

The application value of fusionantigen 38kd-rv1419, 16kd-rv2041c of mycobacterium tuberculosis in the serological diagnosis of tuberculosis

GUO Hong-na

(Dept. of Clinical Laboratory, Yishui Central Hospital of LinYi City, Yishui 276400, China)

Abstract:Objective: To study the application value of fusion antigen 38kD-Rv1419, 16kD- Rv2041c of mycobacterium tuberculosis in the serological diagnosis of TB. Methods: With sputum smear and sputum culture and standard kit as a control, the IgG level of 38kD-Rv1419 and 16kD-Rv2041c in serum of TB group and non-TB respiratory disease group and health control group were detected by Chemiluminescence immunoassay, in order to study its value in serological diagnosis of TB. Results: ① Antibody level of 38kD-Rv1419 and 16kD-Rv2041c in serum of TB group (143621.0±23231.7, 179731.1±16342.1) were obviously higher than that in non-TB group(27417.5±2371.8, 32066.2±3310.9) and health control group (35262.9±5764.2, 22765.5±3695.7), (P<0.05). ② The sensitivity of 38kD-Rv1419(69.0%), 16kD- Rv2041c(72.0%) was higher than that of using sputum culture (21.0%), 38kD kit (20.0%) and 16kD kit (26.0%), (P<0.05). ③ The specificity of 38kD- Rv1419 (85.4%), and 16kD-Rv2041c(83.8%)was higher than that of 38kD kit(61.1%) and 16kD kit(50.0%), (P<0.05). ④ The sensitivity of fusion antigen 38kD-Rv1419 combined with 16kD-Rv2041c was 89.0%, which was higher than that of 38kD-Rv1419 (69.0%), and 16kD-Rv2041c (72.0%), (P<0.05). Conclusion: The sensitivity and the specificity of the fusion antigen 38kD-Rv1419 and 16kD-Rv2041c are high in serological diagnosis in TB, and the sensitivity of 38kD-Rv1419 plus 16kD-Rv2041c is increased in TB dignosis.

Key words:38kD-Rv1491; 16kD-Rv2041c; chemiluminescent immunoassay; serological diagnosis