压电型分子印迹传感器对棉酚的检测*

赵　晨，贾光锋，陆文总

(西安工业大学 电子信息工程学院，西安 710021)



压电型分子印迹传感器对棉酚的检测*

赵晨，贾光锋，陆文总

(西安工业大学 电子信息工程学院，西安 710021)

摘要：为了减小棉酚检测的检测周期，降低检测成本，以分子印迹修的银晶振作为传感器敏感元件，提出了一种新型压电分子印迹传感器.通过对棉酚和其相似物的检测，证实了压电型分子印迹传感器的灵敏性和特异性.结果表明：该传感器的最低检测限为6 μg·L-1，检测范围为6～16 μg·L-1(相关系数R2=0.999 6)，响应时间为15 min；在特异性检测中，该传感器对棉酚的响应频率显著高于相似物.

关键词：分子印迹传感器；棉酚；响应频率；晶振

棉酚是存在于棉属植物中的一种多元酚化合物，具有毒性[1-2].但现代医学发现棉酚还具有很重要的药用价值，如抗生育作用[3]，抗肿瘤作用[4]，抗病毒[5]和抗菌作用[6-7]，特别是抗肿瘤活性[8].因此，棉酚的快速检测已逐渐被研究者重视.目前国内主要使用的是苯胺比色法和紫外分光光度法.但是，苯胺比色法中苯胺具有较高的毒性，操作危险，操作步骤繁琐，不易于区分棉酚和棉酚结构类似物，干扰大.而紫外法虽然操作简便，但样品不易处理，易被杂质干扰，结果不精确.而随着尖端仪器的发展，高效液相法和气相色谱法也应用到棉酚的检测中，这两种方法准确度高，但成本高，周期长，样品需前处理.因此，需要创建一种快速、灵敏的检测棉酚的分析方法.而压电型分子印迹(Molecular Imprinting Polymer-Quartz Crystal Microbalance,MIP-QCM)传感器可解决这一问题.该方法在物质检测中有多方面的应用，文献[9]制备了适于检测卤代烃等物质测定的压电分子印迹压电传感器，该传感器的研究成功更利于传感器的小型化，且易于将印迹聚合物修饰在传感器上.文献[10]制备的压电分子印迹传感器可检测芳香族化合物，且显示了压电型分子印迹传感器良好的稳定性，成本低，高灵敏性和响应时间短等优良特性.为解决棉酚的快速检测，本文将分子印迹技术与压电传感器结合，提出了用于棉酚检测的压电型分子印迹传感器，以期提高棉酚检测的灵敏度，同时减少检测时间.

1压电分子印迹传感器

压电生物传感器是基于压电传感器的基本原理，将具有生物活性的物质如酶、抗体、核酸、蛋白及生物细胞等生物实体修饰于石英晶体的表面作为识别元件.而压电生物传感器的关键元件是压电石英晶片，工作原理是具有各向异性的晶体会受到机械应力而产生电偶极子.但是如果在具有压电效应的材料上施加一个电场，该材料的晶格出现形变，且若施加的电场为交变电场，则晶体晶格将产生机械振动；当该施加的电场频率和晶体的固有频率一致时，则晶体出现压电谐振，此时的频率为称为谐振频率，且该频率与石英晶体物理尺寸和性质相关.1959年，Sauerbrey提出在石英晶体表面加上一层质量负载层，导致晶振频率下降.晶体表面负载的质量与谐振频率之间的关系为

(1)

式中：ΔM为质量的改变(g)；ΔF为质量改变所造成的频率变化；F为石英晶体的谐振频率(Hz)；A为石英晶体的面积(cm2).

压电晶体灵敏度较高，被测物的质量检测限可达1×10-12g，因此振动的石英晶体是灵敏的质量检测器，被称作石英晶体微天平(Quartz Crystal Microbalance，QCM).压电分子印迹传感器传感器主要分石英晶体微天平传感器和表面声波(Surface Acoustic Wave，SAW)传感器.目前，QCM分子印迹(MIP-QCM)传感器应用最为广泛.MIP-QCM传感器的基本原理就是将分子印迹聚合物修饰在石英晶体表面，利用其分子识别功能，当待测模板分子(目标分子)与所固定的识别物相互作用而产生结合时，就会导致晶体表面质量负载的增加，所吸附的模板分子(目标分子)的量可以通过传感器的频率变化加以监测.石英晶体的修饰方法一种是将高聚物粒子固定化于QCM的电极上；另一种则是在电极上“就地”聚合.分子印迹压电生物传感器对被测物的检测在溶液中进行，实时检测被测物与印迹聚合物的结合过程.

2材料与方法

2.1实验材料

四氢呋喃(Tetrahydrofuran，THF)，聚氯乙烯(Polyvinyl Chlorde，PVC)，均为分析纯.棉酚购买于Sigma公司，棉酚相似物(Tetra-Acetylapogossypol)为棉酚中间产物，制备于实验室中.棉酚分子印迹聚合物制备于实验室中[11].

2.2实验方法

2.2.1压电分子印迹传感器的设计

设计检测通道，在检测电路中，将分子印迹聚合物或非印迹聚合物修饰在压电晶体上，分子印迹聚合物与待测物特异性结合，而非印迹聚合物发生了非特异性吸附，将两者频率对比，计算两路频率差值.该过程中，去除了外在的干扰，使结果更为准确.在实验中采用直径 ∅8 mm和 ∅16 mm的两面镀银石英晶体， 5 V工作电压的震荡电路，以及高精度通用计数器对震荡频率进行检测.

2.2.2压电传感器银晶振电极表面修饰

取一定量的分子印迹聚合物或非印迹聚合物溶于10 mL的THF溶液中，超声30 min使溶液分散.然后，加入20 mg聚氯乙烯.在电极以200 rpm的速度旋转的情况下，将该悬浮液滴加到银晶振电极上(20 MHz，直径为 ∅8 mm或 ∅16 mm).当THF溶液在室温下挥发完全后，银晶振电极表面修饰了一层表面分子印迹聚合物.这一过程重复3次，直到银晶振电极表面被修饰好，且分子印迹聚合物的厚度为200 μm.其中分子印迹聚合物的制备在前期工作中已有报道[12-13].

2.2.3分子印迹压电传感器对棉酚的检测

将这5种不同浓度的棉酚溶液以1～2 mL·min-1的速度喷洒到密闭容器中，样品溶液被气化.密闭容器内气化的样品压力稳定时，压电传感器显示与棉酚浓度相关的频率改变.而且压电传感器频率的变化可通过式(1)来计算.当电极表面修饰了印迹聚合物后，ΔF值会减少.而当棉酚与印迹聚合物结合后，ΔF值也会减少.则频率变化为

Δf=ΔF1-ΔF0

(2)

式中：ΔF1为结合物样品时的响应频率；ΔF0为结合样品后压电传感器的响应频率.且其中Δf，ΔF1和ΔF0的值均由频率计数器显示.Δf可消除压电印迹传感器的非特异性结合而产生的误差.同时，也检测了压电传感器的响应时间，随着反应时间的增加，Δf值逐渐增大，到达一定时间后，趋于平缓，此时反应到达饱和，而且此时的Δf值为所求的响应频率.

棉酚分子印迹压电传感器对棉酚相似物质(Tetraacety Lapogossypol)也进行了检测，方法与对棉酚的检测方法相同.通过两者结果的比较可得出分子印迹压电传感器的特异性.棉酚及其相似物的压电传感器检测过程如图1所示.

图1　棉酚分子印迹压电传感器检测示意图Fig.1　The detection of gossypol with piezoelectric imprinting sensor

3结果及分析

3.1分子印迹聚合物对晶振表面的修饰

在实验中发现,制备的表面分子印迹聚合物必须均匀涂布在晶振表面，压电传感器的频率才能达到稳定.为了使表面分子印迹聚合物在THF溶液中分布均匀，采用超声方法.将THF与分子印迹聚合物混合后，进行超声震荡，且超声时间为30 min为最佳.未超声的分子印迹聚合物在晶振表面的分布结果如图2(a)所示，可明显看到印迹聚合物分散不均匀，有的地方密集，有的地方分散.超声处理的结果如图2(b)所示，可看到分子印迹聚合物在超声后分散均匀.

实验结果证明，当THF与表面分子印迹聚合物混合并超声后，再加入聚氯乙烯效果更好.如果将聚氯乙烯、THF和表面分子印迹聚合物一起混合，再超声30 min，超声作用会使胶状物质THF和聚氯乙烯汇聚在一起，导致表面分子印迹聚合物无法均匀分布.如图2(c)所示，可看出印迹聚合物团聚在一起，这是由于THF和聚氯乙烯混合后，将聚合物凝聚在一起.修饰后的压电晶体晶振频率明显下降，且频率值基本稳定.

晶振是压电传感器的转换元件，对其修饰的方法是先将THF与表面分子印迹聚合物混合并超声再加入PVC，如果在修饰过程中，操作不当，致使分子印迹聚合物在晶振表面分布不均匀或形成的印迹聚合物层过厚，会导致晶振频率不稳定，测定结果不准确.

3.2压电型分子印迹传感器的灵敏性检测

使用了两种直径的晶振电极，分别对这两种晶振电极进行了分子印迹聚合物的修饰，并进行棉酚的检测，得到不同的结果.使用直径为∅8 mm的晶振作为压电传感器的电极时，当样品浓度C达到10 μg·L-1时，响应频率达到稳定.即增大样品浓度，响应频率将不再发生变化.而样品浓度为6 μg·L-1时，响应频率能够显示；低于该浓度，压电传感器无法显示，说明压电传感器的检测下限为6 μg·L-1.检测结果如图3(a)所示.对棉酚浓度的检测范围在6～10 μg·L-1，并且在该范围内有好的线性关系(相关系数R2=0.999 8).使用直径为 ∅16 mm的晶振作为压电传感器的电极，结果显示如图3(b)所示.该压电传感器的检测限(信噪比S/N=3)为6～16 μg·L-1，并且在该范围内显示了良好的线性关系(相关系数R2=0.999 6).同时，在该方法中，检测浓度增大到16 μg·L-1时，响应频率趋于平缓，而检测下限依然为6 μg·L-1.这说明分子印迹压电传感器的灵敏度为6 μg·L-1，而检测范围是6～16 μg·L-1.晶振面积对压电分子印迹传感器的检测能力极为重要.直径为 ∅8 mm的晶振由于面积小，检测范围太窄(6～10 μg·L-1)，不适合应用.直径为 ∅16 mm的晶振检测范围可增加到6～16 μg·L-1.但是再增大电极的面积，会导致分子印迹聚合物难于修饰，且修饰的印迹聚合物不均一，而灵敏性降低.

图2　表面分子印迹聚合物的分散状态(300 μm)Fig.2　The dispersed state of surface molecular imprinting polymer (300 μm)

在图3中可看到，非印迹聚合物(Non Imprinted Polymer,NIP)也修饰在压电传感器上，得到非印迹压电传感器(Non Imprinted Polymer-Quartz Crystal Microbalance,NIP-QCM).并使用NIP-QCM对棉酚也进行了检测，并得到结果与MIP-QCM进行了比较.NIP-QCM的值明显要低于MIP-QCM，说明该方法可快速和精确的检测棉酚.

图3　压电传感器对棉酚检测结果Fig.3　QCM detection results for gossypol

同时，通过压电分子印迹传感器与其他检测方法[14-15]的灵敏度比较，压电分子印迹传感器具有更高的灵敏度，见表1.表1给出了高效液相色谱(High Performance Liquid Chromatography-Ultraviolet，HPLC-UV)和压电分子印迹传感器(MIP-QCM)对棉酚检测方法的最低检测限和线性范围.从表1可看出，压电分子印迹传感器的检测限最低 (6 μg·L-1).其最低检测限低于HPLC-UV方法检测限 (3 mg·L-1，见表1).且比HPLC-UV法更简单、便宜和快速.因此，压电分子印迹传感器是一种更为灵敏、快速和高效的检测装置，可广泛应用.

表1　不同方法检测棉酚的灵敏度Tab.1　Sensitivity of different methods

3.3压电分子印迹传感器的特异性

图4为随着时间变化Δf的改变曲线图.检测了棉酚和其相似物对频率响应的比较，表示了压电分子印迹传感器的特异性.棉酚分子印迹压电传感器对棉酚具有很高的响应频率，且响应频率值显著高于相似物.这是由于分子印迹聚合物具有专一与棉酚结合的空间结构和识别位点，这在结合过程中起到关键的作用.因此,被棉酚分子印迹聚合物修饰过的压电传感器同样具有了高的特异性，在识别棉酚时能具有高的响应频率.而识别其相似物时，由于，结合空间和识别位点的不配对，无法结合而具有很低的响应频率.

图4　压电分子印迹传感器对特异性检测Fig.4　Piezoelectric imprinted sensor detection results for selectivity

由图4可看出，随反应时间的增大，Δf值逐渐增大，当时间为15 min时，Δf值趋于稳定，曲线达到平稳状态.这说明压电传感器的响应时间为15 min，表明MIP-QCM在检测棉酚时具有快速响应，高稳定性和高特异性等优点.其高特异性与其他方法的比较见表1，其中压电传感器具有最高的特异性和灵敏性.

3.4压电分子印迹传感器的误差分析

在棉酚检测过程中存在检测数据不稳定、数据出现误差的现象，这是由于压电分子印迹传感器制备过程中多因素导致的测量结果误差.误差产生的原因具体包括：① 石英晶体频率不稳定.由于石英晶体工艺的限制而导致比率不稳定.在选择石英晶体时，应选择工艺好的石英晶体，并进行频率测定，选用频率稳定的石英晶体.② 转换电路的设计要考虑石英晶体的基频，使两者匹配.否则会影响传感器的测量精度.③ 环境干扰.环境对压电分子印迹传感器测定结果有干扰，因此，一个密闭的检测环境可减少外环境对传感器的影响.④ 确保晶体表面洁净.晶体需要在使用前清洗，但是在清洗过程中，电极会受到损伤，影响频率稳定，最终导致检测结果不稳定.

4结 论

将分子印迹聚合物修饰在压电晶体上，提出了一种具有高灵敏性和特异性的压电型分子印迹传感器.该传感器的最低检测限为6 μg·L-1，检测范围为6～16 μg·L-1，响应时间为15 min.对棉酚检测的响应频率显著高于相似物.与紫外法和HPLC-UV法对棉酚检测的灵敏性相比，压电分子印迹传感器的检测限远低于这两种方法.压电分子印迹传感器是一种检测灵敏、检测成本低廉的棉酚检测装置.

参 考 文 献：

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(责任编辑、校对张超)

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DOI:10.16185/j.jxatu.edu.cn.2016.06.013

*收稿日期：2015-11-26

基金资助：陕西省自然科学基础研究计划项目(2014JQ2-8053)

作者简介：赵晨(1981-)，女，西安工业大学讲师，主要研究方向为生物医学工程.E-mail：19379886@qq.com.

文献标志码:中图号：R446.5；TP212A

文章编号：1673-9965(2016)06-0504-06

Gossypol Detection by Piezoelectricity Molecular Imprint Sensor

ZHAOChen,JIAGuangfeng,LUWenzong

(School of Electronic Information Engineering，Xi’an Technological University,Xi’an 710021,China)

Abstract:In order to reduce testing cycle and testing cost in gossypol detection,a novel piezoelectric sensor was developed by sensitive element which was the silver crystal modified by molecular imprinting polymers.Both of sensitivity and specificity for the sensor was confirmed by its detection of gossypol and the similar.The result displayed the perfect characters of this novel sensor,such as detection limit of 6 μg·L-1,detection range of 6～16 μg·L-1(correlation coefficient R2=0.999 6) and response time of 15 min.The response frequency of the sensor to gossypol was much higher than that of similar molecular.

Key words:molecular imprinting sensor;gossypol;response frequency;crystal oscillator