纳米雄黄对卵巢癌细胞增殖凋亡的调控作用及分子机制研究

马淑云，冯志红，唐阳芳，杨　洋，严佳佳

（西安医学院第一附属医院妇科，西安　710077）

纳米雄黄对卵巢癌细胞增殖凋亡的调控作用及分子机制研究

马淑云，冯志红，唐阳芳，杨洋，严佳佳

（西安医学院第一附属医院妇科，西安710077）

【摘要】目的：探讨纳米雄黄对卵巢癌细胞Skov3增殖和凋亡的影响及其潜在分子机制。方法：采用机械研磨法制备纳米雄黄；以Skov3细胞为靶细胞，分别采用MTT实验及流式细胞术检测细胞增殖能力和凋亡情况；同时，利用Westernblot检测细胞内Bcl-2及Bax蛋白的表达变化。结果：纳米雄黄能够显著抑制细胞增殖能力；40mg/L 和80mg/L纳米雄黄处理Skov3细胞48小时，细胞凋亡显著增加；40mg/L纳米雄黄处理Skov3细胞48小时，Skov3细胞内Bcl-2蛋白表达水平显著降低，Bax蛋白表达显著增加。结论：纳米雄黄能够显著抑制Skov3细胞增殖，促进其凋亡，可能通过抑制细胞内Bcl-2蛋白的表达，上调Bax蛋白表达发挥抑制卵巢癌的发生发展的作用。

【关键词】卵巢癌；纳米雄黄；增殖；凋亡；分子机制

卵巢癌最常见的妇科恶性肿瘤之一，发病率居妇科恶性肿瘤第3位［1］。早期卵巢癌治疗效果较好，然而由于卵巢癌早期症状不明显，患者就诊时多处于晚期，目前仍缺乏有效的治疗方法，导致卵巢癌死亡率高居妇科肿瘤第1位［1］。因此，进一步探索寻找新的更为有效的治疗方法，对于改善卵巢癌患者预后具有重要意义。

中药雄黄是我国的一种传统中药，其主要成分为三硫化二砷、四硫化四砷等［2］。现代医学研究表明：雄黄可通过调控细胞增殖及凋亡发挥抑制肿瘤发生发展的作用［3］。然而，传统雄黄制剂在生物利用度低较低的缺点，影响其治疗效果的进一步提高。随着新型药物制备工艺的提高，纳米雄黄越来越多的用于抗肿瘤药物的研究［4，5］。本研究旨在研究纳米雄黄对于卵巢癌SKOV3细胞增殖凋亡能力的调控作用，并探讨潜在分子机制。

1　材料与方法

1.1主要试剂人卵巢癌细胞Skov3购自美国ATCC；胰蛋白酶、胎牛血清、DMEM培养基及二甲基亚砜（DMSO）均购自美国Gibco公司；β-actin、辣根过氧化物酶（HRP）标记鼠及兔二抗单克隆抗体购自美国Santa Cruz公司；青霉素/链霉素购自美国Sigma公司；雄黄原药粉购自陕西康惠制药股份有限公司；Bcl-2及BAX多克隆抗体购自美国CellSigalingTechnology公司；星式球磨机购自南京大学仪器厂。

1.2细胞培养将卵巢癌Skov3细胞培养于DMEM培养基中（含10%胎牛血清及1%青霉素/链霉素），置于5%CO2、37℃细胞培养箱中，饱和湿度下培养。待稳定传代2-3代后，取对数生长期细胞备用。

1.3纳米雄黄制备利用星式球磨机对雄黄原药研磨纳米化，制备的雄黄纳米颗粒呈圆形，大小均匀，平均直径69.98±21.18nm，符合纳米药物制剂的要求。将其溶解于KCl饱和硝酸银溶液，用NaOH调节PH值为7.0，并配置成2mg/ml的储备液，过滤除菌，于4℃保存备用。

1.4MTT法测定细胞增殖能力将100ul的Skov3细胞（5x104/mL）接种于96孔培养板中。分别加入终浓度为10、20、40和80mg/L的纳米雄黄，培养24h、48h和72h后每孔加入5mg/mLMTT溶液10ul孵育4h后，吸出培养液，每孔加入DMSO150ul，于室温轻微溶解结晶15min。每个时间点设6个复孔，并设置阴性对照孔。利用自动酶标仪测定每孔于490nm波长处的吸光度（A）值。根据吸光度值计算细胞增殖抑制率。

1.5流式细胞仪检测细胞凋亡利用纳米雄黄处理Skov3细胞48h后，用0.01mol/LPBS洗涤细胞，1000r/min离心5min后弃去上清，用1×Bindingbuffer重悬细胞并调整细胞数为1×106/mL，每管加入500ul细胞悬液、5ul AnnexinV-FITC和10ulPI。混匀室温避光孵育20min后，进行流式细胞仪检测，每个样本独立重复3次。

1.6Westernblot利用RIPA蛋白提取试剂盒提取细胞总蛋白，并利用BCA蛋白定量试剂盒（BCAkit）检测蛋白样品浓度。取30ug蛋白样品进行SDS-PAGE电泳分离后，利用湿转仪将蛋白转移至PVDF膜上。10%脱脂奶粉封闭2h后，加入TBST稀释的p53多克隆抗体（1∶1000）、Bcl-2多克隆抗体（1∶1000）及β-actin单克隆抗体（mAb，1：1500）4℃孵育过夜后，加HRP标记二抗（1：10000），室温孵育2h。最后利用ECL化学发光剂暗室显影。

1.7统计学分析所有计量数据均以均数±标准误（Mean±SEM）表示，使用SPPSS13.0和GraphPadPrism5统计软件进行统计学分析。两组间比较进行t检验，多组间比较采用单因素方差分析。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2　结果

2.1纳米雄黄抑制卵巢癌Skov3细胞的增殖活性MTT实验结果显示：10mg/L的纳米雄黄处理细胞后，在各时间段对细胞增殖均无显著影响（P＞0.05）；20mg/L的纳米雄黄处理细胞24h后，细胞增殖未被显著抑制（P＞0.05），而处理48h及72h后，细胞增殖活力受到显著抑制（P＜0.05）；用40mg/L及80mg/L纳米雄黄处理细胞24h后，即可见细胞增殖被显著抑制（P＜0.05），而处理48h和72h后，细胞增殖的抑制作用更加显著（P＜0.01），见表1。

表1　不同浓度纳米雄黄对SKOV3细胞的增殖抑制率（%）

2.2纳米雄黄促进卵巢癌Skov3细胞的凋亡如图1所示：用40mg/L和80mg/L纳米雄黄处理Skov3细胞48小时后，细胞凋亡率（%）分别为：21.83±3.25和25.33±3.46，而对照组细胞凋亡率为7.92±2.76，差异具有统计学意义（P＜0.05）。

图1　纳米雄黄对Skov3细胞的凋亡的影响

2.3纳米雄黄抑制卵巢癌Skov3细胞中Bcl-2蛋白的表达Bcl-2是细胞内一种重要的凋亡相关因子，具有抑制细胞凋亡的生物学功能；而Bax蛋白是另一种凋亡相关蛋白，具有促进细胞凋亡发生的生物学功能［6］。Westernblot结果提示：利用40mg/L的纳米雄黄处理Skov3细胞48小时后，细胞内Bcl-2蛋白的表达显著降低，而Bax蛋白的表达显著增加。如图2。

图2　纳米雄黄对Skov3细胞中Bcl-2蛋白及Bax蛋白表达的影响

3　讨论

纳米雄黄是我国传统医学的重要药物之一，可用于治疗痈肿疔疮、蛇虫咬伤、虫积腹疼、惊痫、疟等功用［3］。现代医学研究表明：纳米雄黄能够发挥抑制肺癌、宫颈癌及肝癌等恶性肿瘤的生物学功能［7-9］。纳米雄黄可抑制细胞DNA合成，诱导肿瘤细胞凋亡，增强机体的细胞免疫功能等多种生物学作用发挥抗肿瘤作用［3］。然而，纳米雄黄在卵巢癌是否能够发挥抑癌作用以及具体分子信号机制，目前尚不明确。

细胞凋亡是由基因调控的细胞自主性的死亡，具有高度的保守性，可以通过死亡受体、凋亡抑制蛋白、线粒体和Caspase酶等多个水平实现。其中，Bcl-2家族蛋白和P53蛋白等在调控的信号转导中扮演着非常重要的角色［6］。多种研究表明：肿瘤细胞增殖能力增强和凋亡减少是肿瘤发生发展的重要特征。因此，通过抑制肿瘤细胞增殖，促进细胞凋亡是抑制肿瘤发生发展的重要策略。本研究从纳米雄黄对卵巢癌细胞增殖及凋亡的调控作用为切入点，探讨其在卵巢癌生物学功能及潜在分子机制。MTT实验表明：纳米雄黄对卵巢癌Skov3细胞的增殖能力具有显著抑制作用，并且纳米雄黄对Skov3细胞增殖的抑制作用随药物浓度的增加及药物作用时间的延长而增加；进一步利用流式细胞仪检测表明：纳米雄黄对Skov3细胞的凋亡具有显著促进作用。因此，上述实验结果表明：纳米雄黄能够通过抑制卵巢癌细胞的增殖，促进其凋亡而发挥抑制卵巢癌的作用。

Bcl-2/Bax是近年来被发现的一种重要凋亡相关因子。既往研究表明［6］：Bcl-2具有抑制细胞凋亡的功能，而Bax则具有促进细胞凋亡发生的功能。本研究通过westernblot实验证实：纳米雄黄能够抑制Skov3细胞中Bcl-2蛋白的表达，上调Bax蛋白的表达。这一实验结果提示：纳米雄黄能够通过抑制Bcl-2蛋白表达，上调Bax蛋白的表达，进而发挥促进肿瘤细胞凋亡的作用。

综上，本研究表明：纳米雄黄能够抑制卵巢癌细胞中Bcl-2蛋白表达，上调Bax蛋白的表达，发挥促进卵巢癌细胞凋亡，抑制其增殖的生物学功能。纳米雄黄对于卵巢癌具有潜在的治疗价值，其治疗效果需要未来更多动物实验及前期临床实验的进一步证实。

参考文献

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［3］ 林梅, 裴昌军, 张东生, 等. 雄黄抗癌作用研究进展［J］. 中国实用中医杂志, 2007, 2（13）: 1-4.

［4］ 辉碧, 杨祥良, 谢长生, 等. 纳米技术在中药研究中的应用［J］. 中国药科大学学报, 2001, 32（3）: 161.

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［6］ Rosse T, Olivier R, Monney L, et a1. Bcl-2 prolongs cell survival after Baxinduced release ofcytochrome c ［J］. Nature, 1998, 391（6666）: 496-499.

［7］ 杨碉, 易娟, 陈静, 等. 纳米雄黄对肺癌A549细胞的凋亡诱导作用［J］. 亚太传统医药, 2010, 6（6）: 8-10.

［8］ 刘嵘, 濮德敏, 程艳香, 等. 纳米雄黄混悬液对人宫颈癌细胞RCASl表达的影响［J］. 中国医院药学杂志, 2008, 28（6）: 459-462.

［9］ 杨弱. 纳米雄黄对肺癌和肝癌细胞及其肿瘤干细胞的凋亡诱导作用［D］. 兰州大学, 2010.

通迅作者：马淑云，E-mail：mashuyun36@163.com

【中图分类号】R737.3

【文献标识码】A

【文章编号】1673-016X（2016）03-0014-03

收稿日期：2016-02-12

基金项目：陕西省自然科学基础研究计划资助项目（2012JM4051）

The regulation of Realgar Nanoparticle on the proliferation and apoptosis of human ovarian carcinoma cell and the underlying mechanisms

Ma Shu-yun, Feng Zhi-hong, Tang Yang-fang, Yang Yang, Yan Jia-jia
（Department of gynaecology, First Affiliated Hospital of Xi’an Medical University, Xi’an 710077, Shanxi, China）

［Abstract］Objective To elucidate the effects of Realgar Nanoparticle on the proliferation and apoptosis of SKOV3 human ovarian carcinoma cells and the underlying mechanisms. Methods Preparation of Realgar Nanoparticle was mechanical milled using a high-energy planetary ball mill. The MTT assay and flow cytometry were used to evaluate the proliferation and apoptosis of SKOV3 cells, respectively. Western blot was employed to determine the expression level of Bcl-2 and Bax in SKOV-3 cells. Results Realgar Nanoparticle could significantly inhibit the proliferation of SKOV3 cells, and treating SKOV3 cells with Realgar Nanoparticle （40mg/L and 80mg/L） resulted in significantly increased apoptosis. After being incubated with the Realgar Nanoparticle （40mg/L） for 48h, the expression level of Bcl-2 was significantly reduced and Bax expression level was significantly increased in the SKOV3 cells. Conclusion Realgar Nanoparticle can inhibit the proliferation and induce the apoptosis of Skov3 cells, and the inhibitory effects of Realgar Nanoparticle on ovarian carcinoma are probably exerted by decreasing the expression of Bcl-2 protein and increasing the expression of Bax protein.

［Key words］Ovarian carcinoma； Realgar Nanoparticle； Proliferation； Apoptosis； Molecular mechanisms