肿瘤微环境中Treg细胞和Th17细胞对鼻咽癌进展和预后的影响

蔡曼波，曾益新，邵建永，左建宏，3

（1.南华大学附属第一医院放疗科，衡阳421001；2.中山大学肿瘤防治中心，广州　510060；3.南华大学医学院肿瘤研究所，衡阳　421001）

肿瘤微环境中Treg细胞和Th17细胞对鼻咽癌进展和预后的影响

蔡曼波1，曾益新2，邵建永2，左建宏1，3

（1.南华大学附属第一医院放疗科，衡阳421001；2.中山大学肿瘤防治中心，广州510060；3.南华大学医学院肿瘤研究所，衡阳421001）

【摘要】目的：研究免疫微环境中Treg细胞和Th17细胞对鼻咽癌（Nasopharyngealcarcinoma，NPC）进展和预后的影响。方法：收集2001年1月～2003年12月在中山大学肿瘤防治中心经病理证实为鼻咽癌的石蜡标本557例。所有患者均为初次诊断且未进行任何治疗，随访时间均超过5年。采用免疫组化双染色法检测Treg细胞分子标志物CD4和Foxp3、Th17细胞分子标志物CD4和IL-17，观察并计数，CD4+Foxp3+Treg细胞、CD4+IL-17+Th17细胞在癌巢和间质不同部位的表达数目，统计分析其阳性细胞数目与临床病理特征及与鼻咽癌患者预后的关系。结果：CD4+Foxp3+Treg调节性T细胞主要在肿瘤间质浸润（中位数：2.0/HPF），然而，在557例鼻咽癌组织石蜡切片染色中均未观察到CD4+IL-17+双阳性信号。Kaplan-Meier生存曲线和log-rank统计分析结果表明，间质中的CD4+Foxp3+Treg调节性T细胞与鼻咽癌患者的无瘤生存时间显著正相关，而与总体生存时间虽然存在正相关趋势，但没有达到统计学意义。单因素Cox比例风险模型显示，肿瘤间质中CD4+Foxp3+Treg调节T细胞高数量组发生治疗后转移复发的风险低于数量较少的患者，能一定程度降低患者的死亡风险，但没有达到统计学意义。CD4+Foxp3+Treg调节T细胞在NPC间质中的数量与肿瘤转移复发呈负相关。结论：肿瘤间质中CD4+Foxp3+Treg细胞浸润数量增多与鼻咽癌患者预后呈正相关，降低局部复发，但不能降低死亡风险；在鼻咽癌肿瘤组织中未观察到CD4+IL-17+双阳性信号。

【关键词】肿瘤微环境；鼻咽癌；CD4+Foxp3+Treg细胞；IL-17

调节性T细胞RegulatoryTcells，Treg）是一群具有免疫调节功能的细胞，具有明显的免疫抑制性，该细胞在维持机体免疫、预防免疫性疾病之中起到重要作用［1］。Foxp3分子是赋予Treg细胞免疫抑制功能的主要分子，也是其最具有特异性的可靠的标志分子［2］。近年来，关于Treg肿瘤免疫以及肿瘤免疫治疗逐渐成为研究热点。Th17细胞是新近发现的一类CD4+T细胞亚群，其主要效应分子IL-17，具有强烈的促炎症作用，在多种自身免疫性疾病中发挥着重要作用［3］。本研究采用免疫组化双染色法检测CD4+Foxp3+Treg调节T细胞、CD4+IL-17+Th17细胞，观察并计数双然阳性细胞在癌巢和间质不同部位的表达数目与临床病理特征及与鼻咽癌患者预后的关系。

1　材料和方法

1.1临床样本选取2001年1月～2003年12月经中山大学肿瘤防治中心病理科诊断为鼻咽癌并有相应临床随访资料的组织标本557例。入选条件：（1）所收集蜡块均为患者首次就诊诊断为鼻咽癌的活检标本。（2）观察HE切片，选择癌巢较大的鼻咽癌石蜡标本。（3）标本齐全，有完整临床随访资料。（4）死于其它疾病（非鼻咽癌）或意外死亡的病人被剔除。

1.2免疫组化方法分子标记物CD4、Foxp3和IL-17采用免疫组化双染法检测。将组织芯片置入56℃恒温箱，烘片30-60min，将切片取出后，常规脱蜡、脱水；双内源酶阻断剂阻断6分钟，消除内源性过氧化物酶的活性；抗原修复后，PBS清洗后，滴加一抗（第一种），4℃过夜。PBS清洗后，Polymer/HRP37℃孵育30分钟，PBS清洗后，滴加显色剂DAB（DAB用SubstrateBuffer 按1：50稀释）显色，自来水终止。PBS清洗后，双染阻断剂室温孵育4分钟，PBS清洗后，滴加一抗（第二种），4℃过夜，PBS清洗后，Rabbit/MouseLINK）室温孵育11分钟，PBS清洗后，Polymer/AP37℃孵育30分钟，PBS清洗后，滴加显色剂PermanentRed（用SubstrateBuffer 按1：100稀释）显色，自来水终止。苏木素复染1分钟，自来水终止显色，盐酸酒精分化，苏木素复染，晾干或吹干后中性树胶封片。

1.3免疫组织化学结果判断免疫组化结果判定采用双盲法，由三名对病例资料完全不知情的病理医生对结果进行判定，CD4阳性信号定位于淋巴细胞胞膜，IL-17阳性信号定位于淋巴细胞胞浆，FOXP3阳性信号定位于淋巴细胞胞核。所有计数均在400倍高倍显微镜下随机观察5个不重复且具代表性的视野，计数每个视野下阳性细胞个数，取其平均值即为各免疫细胞亚群的密度。

1.4统计分析应用SPSS16.0软件包进行统计学处理。计数资料的检验采用X2检验，相关性分析采用Pearson法，Kaplan-Meier法比较生存情况（log-rank检验），Cox比例风险模型进行预后的多因素分析，并计算风险比（hazardratio，HR）和95%置信区间（confidence interval，CI），最终得到可以独立预测预后的参数。所有统计分析均以P＜0.05为有统计学意义。

2　结果

2.1CD4、FOXP3、IL-17在鼻咽癌组织中的表达情况

在鼻咽癌组织中，CD4表达于淋巴细胞胞膜，Foxp3表达于淋巴细胞胞核，IL-17表达于淋巴细胞胞浆。研究发现，CD4+Foxp3+调节性T细胞主要在肿瘤间质浸润（箭头表示）（中位数：2.0/HPF），极少在肿瘤癌巢中浸润。然而，我们应用免疫双染的方法很少发现CD4与IL-17的共定位（箭头表示），故未计数CD4+IL-17+TH17细胞在鼻咽癌微环境的密度。

图1　CD4+Foxp3+　Treg细胞和CD4+Foxp3+TH17细胞在鼻咽癌癌巢和间质中的表达

2.2CD4+Foxp3+Treg细胞在癌巢和间质中的数量与鼻咽癌患者预后的影响结合患者的临床随访资料，进一步分析这些免疫细胞是否会影响患者的预后。以ROC曲线建立的cutoff值为临界值，将巨噬细胞的数量分为高/低表达数量组。Kaplan-Meier生存曲线和log-rank统计分析结果表明，间质中的CD4+Foxp3+Treg细胞与鼻咽癌患者的无瘤生存时间（P＜0.01）显著正相关，而与总体生存时间虽然存在正相关趋势，但没有达到统计学意义（图2）。

图2　间质组织CD4+Foxp3+　调节性T细胞与患者的Kaplan-Meier累计生存曲线

2.3CD4+Foxp3+Treg细胞在癌巢和间质中的数量对鼻咽癌患者进展的影响采用单因素Cox比例风险模型评价CD4+Foxp3+Treg细胞对患者治疗后转移复发及死亡的风险比（表1）。肿瘤间质中CD4+Foxp3+调节T细胞高数量组发生治疗后转移复发（HR，0.655；95% CI：0.491-0.875，P=0.009）的风险显著低于低数量组的患者，能一定程度上降低患者的死亡风险，但未达到统计学意义（HR，0.76；95%CI：0.551-1.047，P=0.093）。

表1　CD4+Foxp3+Treg细胞的总生存和无瘤生存的单因素Cox比例风险模型

2.4间质中CD4+Foxp3+Treg细胞与各项临床参数之间的相关性肿瘤微环境中的CD4+Foxp3+Treg细胞能显著影响患者的预后，浸润数量增多能明显降低患者治疗后转移复发及死亡风险。我们进一步分析间质中CD4+Foxp3+Treg细胞与各项临床参数之间的相关性。结果如表2所示，CD4+Foxp3+Treg细胞在NPC间质中的数量与肿瘤转移复发呈负相关（Pearson’sR=-0.105，P=0.013）。

表2　CD4+Foxp3+　Treg细胞与临床病理参数的相关性

3　讨论

鼻咽癌是在中国华南地区非常常见的一种恶性肿瘤，它与EB病毒（EBV）的感染相关，其肿瘤组织局部存在大量淋巴细胞和其它免疫浸润［4］。以往对肿瘤基础研究较多注重肿瘤细胞内发生的一系列分子事件。然而，肿瘤的发生发展，既缘于细胞的“内因”；但越来越多的研究表明，该过程不仅涉及肿瘤细胞内发生的分子事件，更重要的是一个涉及到肿瘤微环境的复杂的生物学行为，包括肿瘤细胞与肿瘤微环境中的各种间质细胞的相互作用［5-7］。在肿瘤发展过程中，机体的免疫系统常常呈现免疫抑制状态。T细胞是淋巴细胞中数量最多、功能最复杂的一类细胞。CD4和CD8是区分成熟T细胞亚群的主要表面标志。其中CD4+T细胞通过分泌不同的细胞因子，对免疫系统的整体功能具有重要的调控作用。目前确定的CD4+T细胞亚群主要包括1型辅助性T细胞Thelpertype1cells，Th1）、2型辅助性T细胞Thelpertype2cells，Th2）、17型辅助性T细胞Thelpertype17cells，Th17）、滤泡辅助性T细胞和调节性T细胞regulatoryTcells，Treg）等。其中，Treg细胞是目前发现的一种具有免疫抑制功能的重要CD4细胞亚群。无论鼠类还是人类Treg细胞都特征性表达FOXP3分子，作为核转录因子forkhead/winged-helix叉头样/翼状螺旋）家族的成员，其编码基因位于X染色体。Foxp3分子是赋予Treg细胞免疫抑制功能的主要分子，也是其最具有特异性的可靠的标志分子［1］。

作为肿瘤免疫逃逸的机制之一，调节性T细胞（Treg）主要是通过抑制效应细胞的免疫反应来抑制机体的抗肿瘤免疫应答。目前，有报道在多种肿瘤患者外周血和肿瘤组织中发现Treg细胞数目增多和比例升高，且与患者的临床预后存在相关性，但在不同类别肿瘤中情况又有所不同。课题组之前发现FOXP3+TIL细胞浸润数目与鼻咽癌患者T分期负相关，与总生存期和无瘤生存期呈正相关［8］。调节性T细胞对鼻咽癌进展和预后的影响仅为初步探讨，未针对鼻咽癌微环境中CD4+FOXP3+Treg细胞进行观察，且当时研究的临床病例数较少（106例），调节性T细胞对鼻咽癌患者预后需进一步观察。因此，在本研究中，我们收集了557例鼻咽癌患者5年完整随访资料，首次应用免疫组化双染法检测了鼻咽癌组织局部浸润的CD4+FOXP3+Treg细胞和CD4+IL-17+Th17细胞。通过对各免疫细胞亚群进行计数统计，我们发现鼻咽癌组织局部主要是以在肿瘤间质浸润的CD4+FOXP3+Treg细胞为主，很少有CD4+IL-17+双阳性的Th17细胞，在癌巢中较少有Treg细胞浸润。在我们研究结果中，CD4+FOXP3+Treg的细胞数目与鼻咽癌肿瘤转移复发呈负相关，能降低治疗后的鼻咽癌患者的转移复发风险，一定程度患者的死亡风险，与鼻咽癌患者的无瘤生存时间显著正相关，而与总体生存时间虽然存在正相关趋势，但没有达到统计学意义。与课题组之前研究的CD8+FOXP3+Treg对鼻咽癌患者的预后一致［8］，也与EBV相关的滤泡性淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤中的报导相同［9］。此外，在少数实体瘤中也有类似报道，如头颈癌和结肠癌［10-11］。研究提示，鼻咽癌间质浸润的CD4+FOXP3+Treg细胞是患者预后良好的指标，其原因可能这类细胞并不具有免疫抑制功能，而为促进肿瘤患者的免疫应答功能。

在某些肿瘤患者的外周血、肿瘤组织或转移的淋巴结内可以检测到Th17细胞［3］。在卵巢癌中发现Th17细胞的数量与患者的预后呈正相关，而与疾病进展呈负相关关系［12］；肝癌中也有报道Th17细胞的数量与患者的预后负相关［13］。本研究首次在鼻咽癌芯片组织中检测了CD4+IL-17+双阳性Th17细胞的表达数目，但在肿瘤癌巢和间质均未检查到明显CD4+IL-17+双阳性Th17细胞浸润。

本研究是首次在鼻咽癌中应用免疫组化双染法来检测肿瘤浸润CD4+FOXP3+Treg细胞和CD4+IL-17+Th17细胞亚群的表达情况，分析其各自的表达数目与鼻咽癌患者临床病理特征的相关性及对预后的影响，在一定程度上切实反映了鼻咽癌局部肿瘤微环境中免疫状况及其对患者临床转归的影响。免疫微环境中的CD4+FOXP3+Treg细胞在间质中的浸润在鼻咽癌中倾向于促进机体的免疫应答，抑制肿瘤的复发和转移，这为临床研究鼻咽癌的免疫治疗提供了新思路。

参考文献

［1］ Luo CT, Liao W, Dadi S, et al. Graded Foxo1 activity in Treg cells differentiates tumour immunity from spontaneous autoimmunity［J］. Nature, 2016, 5297587）: 532-536.

［2］ Fujii H, Josse J, Tanioka M, et al. Regulatory T Cells in Melanoma Revisited by a Computational Clustering of FOXP3+T Cell Subpopulations［J］. J Immunol, 2016. ［Epub ahead of print］

［3］ Young MR, Levingston CA, Johnson SD. Treatment to sustain a Th17-type phenotype to prevent skewing toward Treg and to limit premalignant lesion progression to cancer. Int J Cancer, 2016. ［Epub ahead of print］

［4］ Shen Y, Zhang S, Sun R, et al. Understanding the interplay between host immunity and Epstein-Barr virus in NPC patients［J］. Emerg Microbes Infect, 2015, 4（3）: 1-8.

［5］ Lee SJ, Yang CS, Kim DD, et al. Microenvironmental interactions and expression of molecular markers associated with epithelial-to-mesenchymal transition in colorectal carcinoma［J］. Int J Clin Exp Pathol, 2015, 1； 811）: 14270-1482.

［6］ Jolly LA, Novitskiy SV, Owens P, et al. Fibroblast-mediated collagen remodeling within the tumor microenvironment facilitates progression of thyroid cancers driven by BrafV600E and Pten loss［J］. Cancer Res, 2016, ［Epub ahead of print］

［7］ Thompson E, Taube JM, Elwood H, et al. The immune microenvironment of breast ductal carcinoma in situ［J］. Mod Pathol, 2016, ［Epub ahead of print］.

［8］ Zhang YL, Li J, Mo HY, et al. Different subsets of tumor infiltrating lymphocytes correlate with NPC progression in different ways［J］. Mol Cancer, 2010, 9: 4.

［9］ Bhattacharya K, Chandra S, Mandal C. Critical stoichiometric ratio of CD4+CD25+FoxP3+regulatory T cells and CD4+ CD25- responder T cells influence immunosuppression in patients with B-cell acute lymphoblastic leukaemia［J］. Immunology, 2014, 14（21）: 124-139.

［10］ Liu Y, Yun X, Gao M, Yu Y, Li X. Analysis of regulatory T cells frequency in peripheral blood and tumor tissues in papillary thyroid carcinoma with and without Hashimoto’s thyroiditis［J］. Clin Transl Oncol, 2015； 17（4）: 274-80.

［11］ Salama P, Phillips M, Grieu F, et al. Tumor-infiltrating FOXP3+ T regulatory cells show strong prognostic significance in colorectal cancer ［J］. J Clin Oncol, 2009； 272）: 186-192.

［11］ Xiang T, Long H, He L, et al. Interleukin-17 produced by tumor microenvironment promotes self-renewal of CD133+ cancer stemlike cells in ovarian cancer［J］. Oncogene, 2015, 34 （2）: 165-176.

［12］ Wan X, Cheng C, Lin Z, et al. The attenuated hepatocellular carcinoma-specific Listeria vaccine Lmdd-MPFG prevents tumor occurrence through immune regulation of dendritic cells［J］. Oncotarget, 2015, 611）: 8822-8838.

【中图分类号】R739.63

【文献标识码】A

【文章编号】1673-016X（2016）03-0001-04

收稿日期：2016-01-10

基金项目：国家基础研究发展计划（973计划）（2013CB910301）,国家自然科学基金项目（81272960）,湖南省卫生厅项目（B2014-051）,湖南省自然基金项目（S2016J504B）和湖南省重点项目（2013WK2010）

通讯作者：左建宏,E-mail:632138414@qq.com

Influence of Treg and Th17 Cell in the Tumor Microenvironment on Progression and Prognosis
of Nasopharyngeal Carcinoma

Cai Man-bo1, Zeng Yi-xin2, Shao Jian-yong2, Zuo Jian-hong3
（1. The First Affiliated Hospital of University of South China, Hengyang 421001, China； 2. State Key Laboratory of Oncology in South China, Cancer Center, Sun Yat-Sen University, Guangzhou 510060, 3. Institute of Oncology, School of Medicine of University of South China, Hengyang 421001）

［Abstract］Objective This study was to investigate the influence of Treg and Th17 Cell on the progression and prognosis of nasopharyngeal carcinoma NPC）. Methods 557 nasopharyngeal carcinoma paraffin specimens were collected from January 2001 and December 2003 in cancer center of Sun yat-sen university. All the patients without treatment and with 5 yeas followup were included. Double immunohistochemical staining was performed with CD4/FOXP3 and CD4/IL-17 in 557 patients, statistis analyzed the relationship between the positive cells from different parts with the clinical pathological characteristics and the prognosis of NPC patients. Results We found that CD4+Foxp3+ Treg cell infiltration mostly in the stroma of nasopharyngeal carcinoma median: 2.0/HPF）. No co-expression of IL-17 and CD4 was found in NPC TILs by double immunohistochemical staining. Kaplan-Meier survival curve and the log-rank statistical analysis results show that the number of CD4+Foxp3+ Treg cell in stroma were significantly positive correlation with disease-free survival time. Although there is positive correlation with overall survival time trend, but did not reach statistical significance. Single factor Cox proportional hazards model shows that the recurrent and metastasis transfer risk is lower with the more infiltration of CD4+Foxp3+ Treg cell in the stroma than a small number of patients after treatment. CD4+Foxp3+ Treg cell reduce the risk of death to a certain extent in patients, but didnot reach statistical significance. More number of CD4+Foxp3+ Treg cell in the stroma has lower recurrence and metastasis of transfer of patients after treatment in patients than a small number. Conclusion The number of CD4+Foxp3+Treg infiltration in the and stroma of the immune microenvironment was positively related with the prognosis of NPC patients, and it reduce the risk of local recurrence and distant metastasis.

［Key words］the tumor microenvironment； Nasopharyngeal carcinoma； CD4+Foxp3+Treg cell； IL-17