L型钙离子通道α1C亚基基因多态性与精神分裂症的相关性

洪汉林段秀荣刘婵媛

L型钙离子通道α1C亚基基因多态性与精神分裂症的相关性

洪汉林*段秀荣*刘婵媛*

目的 探讨L型钙离子通道α1C亚基（calcium channel，voltage-dependent，L type，alpha 1C subunit，CACNA1C）基因多态性与精神分裂症的关系。 方法 纳入118例精神分裂症患者及122名对照，采用变性高效液相色谱法对其CACNA1C基因rs10848683、rs2238032、rs2299661位点进行基因分型，通过病历资料收集患者感知觉障碍、思维障碍、情感障碍和行为障碍等临床表现，采用阳性与阴性症状量表（positive and negative syn⁃drome scale，PANSS）评估患者症状。 结果 rs2238032和rs2299661位点基因型和等位基因在患者组与对照组间分布有统计学差异（均P＜0.05），而rs10848683位点基因型和等位基因分布在组间无统计学差异（P＞0.05）。rs2238032位点TT基因型（OR=0.394）和rs2299661位点CG（OR=0.326）与精神分裂症的患病风险有关联（均P＜0.05）。rs10848683位点各基因型患者行为障碍分布有统计学差异（P＜0.05）；rs2238032各基因型患者思维障碍、情感障碍和PANSS得分有统计学差异（均P＜0.05）；rs2299661各基因型患者感知觉障碍、PANSS得分有统计学差异（均P＜0.05）。单体型分析示，CTC（OR=1.811）、CTG（OR=0.432）和TGC（OR=1.771）与精神分裂症关联有统计学意义（P＜0.05）。 结论 CACNA1C基因多态性与精神分裂症及其临床表现有关联。

CACNA1C基因 精神分裂症 基因多态性

【Abstract】Objective To examine the relationship of calcium channel，voltage-dependent，L type，alpha 1C subunit （CACNAIC）gene polymorphism with schizophrenia.Method A total of 118 patients with schizophrenia and 122 healthy volunteers were selected in succession.Denaturing high performance liquid chromatography（DHPLC）was used to analyze the genotypes of CACNAIC gene（rs10848683，rs2238032 and rs2299661）.Medical record data of patients with schizophre⁃nia and the clinical manifestation of the patients（sensation and perception disorder，thought disorder，affective disorder and behavior disorder）were collected.The clinical phenotype databases of all patients were established.Result There were statistical differences for genotype and allele distribution of the rs2238032 and rs2299661 between patient group and control group（P＜0.05）.The TT genotype of rs2238032（OR=0.394）and the CG genotype of rs2299661（OR=0.326）associ⁃ated with the risk of schizophrenia.The genotype distribution of rs2238032 was related to the thought disorder，the emotion disorder and the PANSS score of schizophrenia patients（all P＜0.05）.The genotype distribution of rs2299661 was related to the perceptual disorders and PANSS score of schizophrenia patients（all P＜0.05）.Haplotype analysis showed that CTC （OR=1.811），CTG（OR=0.432）and TGC（OR=1.771）were significantly associated with schizophrenia（P＜0.05）.Conclu⁃sion The CACNA1C gene polymorphism is associated with schizophrenia and its clinical manifestations.

【Key words】CACNA1C Schizophrenia Polymorphism

遗传因素在精神分裂症发病中具有重要作用［1-2］。L型钙离子通道α1C亚基基因（calcium channel，L type，alpha1C subunit gene，CACNA1C）编码L型钙通道α1C亚基，该亚基可组装成CaV1.2钙离子通道蛋白［3］。研究表明，CACNA1C与神经系统树突形成、神经元存活、突触可塑性及记忆能力有关［4］。最近分子遗传学研究发现，CACNA1C的多态性及异常表达与精神分裂症显著相关，包括rs1006737、rs4765905、rs7297582等多个单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）［5-8］。但是目前关于CACNA1C基因位点与精神分裂症关联的研究还存在分歧［10-11］。CACNA1C基因rs10848683、rs2238032和rs2299661位点分别是人12号染色体上的C/T、G/T和C/G单核苷酸变异，可能改变其蛋白产物功能［12-13］。而目前有关CAC⁃NA1C基因rs10848683、rs2238032和rs2299661位点与精神分裂症相关性的研究较少［8，14］。根据既往研究中所报道的与精神疾病相关CACNA1C基因阳性位点［8，14-15］，结合HapMap中的中国汉族人群基因组数据，本研究拟探讨CACNA1C基因rs10848683、rs2238032、rs2299661位点多态性及基因表达与精神分裂症的关系。

1　对象与方法

1.1研究对象 本研究采用病例对照设计。连续入选2013年10月至2014年10月于武汉市武昌医院精神科住院精神分裂症患者为患者组。纳入标准：①符合《美国精神障碍诊断与统计手册第四版》（Diagnostic and Statistical Manual of Mental Dis⁃orders，Fourth Edition，DSM-Ⅳ）精神分裂症诊断标准；②入组前至少1个月未服用任何抗精神病药物；③6个月内未接受过电休克治疗；④有一定的文化水平，能够理解和遵守研究要求。排除标准：①合并其他符合DSM-IV诊断标准疾病或其他认知障碍者，物质或酒精依赖、滥用者；②患有严重躯体疾病者；③有癫痫或高热惊厥病史者；④妊娠、哺乳期妇女或计划妊娠者；⑤入组前4周内参与其他临床研究者；⑤临床资料不完整的患者。共入组118例患者。另选择同期行健康体检的志愿者作为对照组。纳入标准：①无精神疾病史；②无重大躯体疾病；③与患者无血缘关系；④年龄、性别、受教育年限与患者匹配。排除标准：①妊娠、哺乳期妇女或计划妊娠者；②入选前4周内参与其他临床研究者。共纳入122名对照。本项研究得到我院伦理委员会批准，受试者或其法定监护人均签署知情同意书。

1.2 CACNA1C基因多态性检测 早晨抽取患者组和对照组空腹外周静脉血5 mL，EDTA抗凝。提取DNA按DNA试剂盒（德国Qiagen公司）说明书操作，采用紫外分光光度仪检测DNA含量。选择rs10848683 C/T、rs2238032 G/T、rs2299661 C/G等3个SNP位点进行多态性检测。采用PCR法扩增目的基因。使用Prim⁃erPremier5.0软件设计3个位点的PCR扩增引物：引物序列rs10848683正向为5'-CTGGGATGCTCAGAGCC AGGGCACT-3'，反向为5'-AGTGCCCTGGCTCTGAG CATCCCAG-3'；rs2238032正向为5'-GGGAGGTGGC TGGGAGAGGCGCCA-3'，反向为5'-TGGCGCCTCTC CCAGCCACCTCCC-3'；rs2299661正向为5'-TAATG TGTTGTGTTGTATCTGTTTCT-3'，反向为5'-AGAAA CAGATACAACACAACACATTA-3'。引物由上海生物工程技术有限公司合成。PCR反应条件：94℃预变性2 min，94℃变性1 min，52℃退火1 min，72℃延伸1 min，35个循环；72℃延伸5 min。PCR产物于4℃保存。采用变性高效液相色谱法（denaturing high performance liquid chromatography，DHPLC）在部分变性条件下检测所有样品基因型，柱温为59.3℃，流动相流速为0.9 mL/min。基因型片段长度基因分型分两步完成：第一步DHPLC呈双峰的为杂合子基因型；第二步将呈单峰的PCR样品与经测序证实的野生纯合子基因型样品等量混合后再进行DHPLC，单峰的为野生纯合子基因型，双峰的为突变纯合子基因型。

1.3精神分裂症患者临床资料收集 查询患者病历资料，收集其社会人口学资料和临床表现（感知觉障碍、思维障碍、情感障碍和行为障碍）。由主管医师记录详细情况，建立临床表现数据库。采用阳性与阴性症状量表（positive and negative syn⁃drome scale，PANSS）［16］评估患者症状，分别计算阳性症状分量表（P）、阴性症状分量表（N）和一般精神病理学分量表（G）得分。

1.4统计学方法 用SPSS 20.0进行统计分析。采用χ2检验对对照组的基因型分布进行Hardy-Wein⁃berg平衡检验。患者组与对照组基因型与等位基因频率和临床表现比较采用χ2检验，各位点3种基因型患者的PANSS得分比较采用方差分析，两两比较采用LSD法。计算优势比（odds ratio，OR）及其95%可信区间（confidence interval，CI）反映各位点与精神分裂症的关联。以HapMap网站中国汉族人群CACNA1C基因组数据为基础，采用Hap⁃loview软件分析基因的连锁不平衡情况。利用SHEsis软件对rs10848683、rs290487和rs11196218位点进行单体型分析，3个位点共产生8种单体型，舍弃在每组中频率小于0.03的基因型。患者组和对照组的单体型频率比较采用χ2检验，单体型与精神分裂症的关联用OR值及其95%CI分析。统计效能（statistical power）采用Power and Sample Size Program软件进行分析。检验水准α为0.05，双侧检验。

2　结果

2.1社会人口学资料 患者组118例患者中男性57例，女性61例；年龄19～58岁，平均（38.1±6.2）岁；39例有吸烟史，45例有饮酒史；受教育年限2～16年，平均（10.5±3.3）年。对照组共122名对照，其中男性58名，女性64名；年龄18～56岁，平均（37.2±6.1）岁；41例有吸烟史，47例有饮酒史；受教育年限3～16年，平均（10.2±3.1）年。两组年龄（t=1.135，P=0.259）、性 别 构 成（χ2=0.014，P= 0.906）、吸烟史（χ2=0.008，P=0.927）、饮酒史（χ2= 0.004，P=0.951）和受教育年限（t=0.721，P=0.459）差异均无统计学意义。

2.2 Hardy-Weinberg平衡检验和连锁情况分析对照组CACNA1C基因rs10848683（χ2=0.971，P= 0.324）、rs2238032（χ2=3.344，P=0.068）、rs2299661 （χ2=2.403，P=0.122）位点基因型分布符合Har⁃dy-Weinberg平衡。

rs10848683和rs2238032（D’=0.960，r2= 0.543）、rs10848683和 rs2299661（D’=0.900，r2= 0.378）及 rs2238032和rs2299661（D’=0.873，r2= 0.332）位点之间均存在连锁不平衡。见图1。

图1 CACNA1C基因3个位点连锁程度分析

2.3基因型与等位基因分布 rs10848683位点的基因型频率和等位基因频率在患者组和对照组间无统计学差异（均P＞0.05）。rs10848683位点等位基因和基因型统计检验的效能（1-β值）分别为0.050 和0.059，表明该位点结果可能是由于样本量较少造成的假阴性。患者组和对照组rs2238032位点基因型（χ2=7.354，P=0.025）和等位基因（χ2=8.380，P=0.004）分布有统计学差异，TT基因型（OR= 0.394，95%CI：0.178～0.875）及T等位基因（OR= 0.565，95%CI：0.383～0.833）与精神分裂症相关联（P＜0.01）。两组间rs2299661位点基因型（χ2= 13.772，P=0.001）和等位基因（χ2=12.731，P＜0.001）分布有统计学差异，CG基因型（OR=0.326，95%CI：0.173～0.615）及G等位基因（OR=0.432，95% CI：0.270～0.690）与精神分裂症相关联（P＜0.01）。见表1。

表1患者组和对照组CACNA1C基因3位点的基因型和等位基因分布［n（%）］

2.4 CACNA1C基因多态性与精神分裂症临床表现关系rs10848683位点各基因型患者仅行为障碍分布有统计学差异（χ2=11.550，P=0.021）。rs2238032位点各基因型患者思维障碍（χ2= 30.880，P=0.002）、情感障碍（χ2=10.520，P=0.033）分布差异有统计学意义，PANSS中G分有统计学差异（F=8.241，P=0.001）。rs2299661位点各基因型患者感知觉障碍（χ2=11.340，P=0.023）、PANSS 中N分（F=3.299，P=0.040）和G分（F=4.494，P= 0.013）有统计学差异。见表2。

2.5 CACNA1C基因3个位点单体型分析 单体型中TTG、TGG、CGC和CGG在各组中频率小于0.03，不纳入分析。两组间CTC（χ2=9.342，P= 0.002）、CTG（χ2=9.342，P＜0.001）和TGC（χ2=8.397，P=0.004）单体型的分布有统计学差异。关联分析结果显示，单体型CTC（OR=1.811，95%CI：1.235～2.656）、CTG（OR=0.432，95%CI：0.270～0.690）和TGC（OR=1.771，95%CI：1.200～2.613）分别与精神分裂症关联有统计学意义（P＜0.01）。见表3。

3　讨论

CACNA1C基因位于12p13.3号染色体的短臂，是横跨大约6.45 Mb的一段基因组区域［11］。CACNA1C 是CaV1.2钙离子通道蛋白的关键组成部分，对于该通道蛋白的钙离子结合能力、通道敏感性起决定作用；CaV1.2介导胞外钙离子进入细胞，从而提高细胞转录水平及信号通路的活性［3］。CACNA1C多态性与情感障碍、精神分裂症、抑郁症等精神疾病有关，是多种精神疾病的易感基因［8］。目前已经发现CACNA1C基因多个多态性位点与精神疾病之间存在一定相关性，其中包括 rs4765905、rs1006737、rs2370419等 ：GREEN 等［18］发 现rs1006737可使早期复发性抑郁和精神分裂的风险明显增加，并且此位点与双相情感障碍有关；HAMSHERE等［19］则发现rs4765905和精神分裂症存在高度联系；DAO等［20］指出 rs2370419和rs2370411显著增加女性患抑郁症及双相情感障碍的风险。但国内外对于本研究选用的3个位点（rs10848683、rs2238032和rs2299661）与精神分裂症关系的研究较少。

本研究以HapMap中的中国汉族人群基因组数据为基础，通过文献查阅寻找Tag-SNP，以及通过FASTSNP软件寻找CACNA1C基因的功能性变异位点等 3种方法，最终选择 rs10848683、rs2238032和rs2299661作为本研究检测的多态性位点。结果显示，rs10848683位点的基因型频率和等位基因频率在患者组和对照组间无统计学差异，但该统计检验的效能（1-β）值非常低，仅为0.050和0.059，表明该位点的结果可能是由于样本量较少造成的假阴性。本研究中患者组和对照组rs2238032位点TT基因型及T等位基因，以及rs2299661位点CG与GG基因型及G等位基因与精神分裂症相关联。rs2238032和rs2299661位点处于CACNA1C基因的内含子中，这些位点可以通过在mRNA水平上改变mRNA前体的剪接方式而影响CACNA1C基因的表达，最终影响精神分裂症的发生和发展［12］。研究认为Cav1.2参与细胞膜钙离子通透性改变，导致细胞内信号途径活性和基因转录及突触可塑性改变，对调整大脑高级复杂功能如认知、情感、行为等起着重要作用［8］。CACNA1C 是CaV1.2钙离子通道蛋白的关键组成部分，CAC⁃NA1C基因rs2238032（G/T）和rs2299661（C/G）可能会导致其蛋白产物功能失调，从而与精神分裂症的发生相关［12，14］。另外，就CACNA1C基因多态与精神分裂症患者的临床表现来看，本研究发现，rs10848683位点各基因型患者的行为障碍存在统计学差异，rs2238032位点各基因型患者的思维障碍、情感障碍和PANSS中G得分存在统计学差异，rs2299661位点各基因型患者的感知觉障碍、PANSS中N得分和G得分有统计学差异。以上结果表明CACNA1C基因不同位点多态性与精神分裂症患者不同临床表现具有相关性。最后，对上述3个位点进行单倍体分析，结果显示单体型CTC和TGC是精神分裂发生的危险因素，而CTG是精神分裂症发生的保护因素。CACNA1C多态性与情感障碍、精神分裂症、抑郁症等精神疾病有关，是多种精神疾病的易感基因，但其具体机制目前尚不明确，需要通过基础研究以及系统完善的临床研究，进一步了解CACNA1C在精神疾病中的作用［5-9］。

表2 CACNA1C基因3位点基因型与精神分裂症患者临床表现的关系［n（%）］

表3患者组和对照组CACNA1C基因3位点单体型分析［n（%）］

本研究表明CACNA1C基因多态性及其蛋白表达与精神分裂症及其临床表现具有一定的相关性，这为探讨CACNA1C基因表达与精神分裂症发生机制的研究提供了更多依据。同时本研究也对于抗精神病药物的研究和筛选提供了潜在的靶点，为治疗精神分裂症提供一定的理论依据。但是本研究存在样本量小的缺陷，可能影响相关性分析结果的可靠性，因此未来可以在更大样本量的对象中进行研究。

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（责任编辑：肖雅妮）

Relationship of CACNA1C gene polymorphism with schizophrenia.

HONG Hanlin，DUAN Xiurong，LIU Ch⁃anyuan.Department of Psychiatry，Wuchang Hospital of Wuhan City，Wuhan 430000，China.Tel：027-51154278.

R749.3

A

10.3969/j.issn.1002-0152.2016.04.002
*湖北省武汉市武昌医院精神科（武汉 430000）

（E-mail：drliuchanyuan@163.com）

2015-10-16）