地黄煎煮过程中不同时间及煎煮液中梓醇的动态变化规律及对其止血作用的影响对比研究

杨炳臣

地黄煎煮过程中不同时间及煎煮液中梓醇的动态变化规律及对其止血作用的影响对比研究

杨炳臣

【摘要】目的 对比分析地黄煎煮液中不同煎煮时间里梓醇含量的变化情况以及随煎煮时间的不同其止血作用的变化情况。方法 不同煎煮时间里梓醇含量的测定采用高效液相（HPLC）来测定，并采用剪尾法以及毛细玻管法探究不同的煎煮时间及其对小鼠的止血作用变化情况。将随机选取的96只小鼠分为8个空白对照组，并将地黄的煎煮时间分别设定为15 min，30 min，45 min，60 min，90 min，120 min以及180 min。对小鼠连续给药1周，在第8 d早上对小鼠给药40 min后，分别测定各给药组小鼠的出血时间以及凝血时间。并对比分析各组结果。结果 地黄煎煮液中梓醇含量的变化随煎煮时间的不同而不同，刚开始梓醇含量随煎煮时间的加长而升高，煎煮时间为60 min时含量达到最高；之后梓醇含量随煎煮时间的继续加长而降低。在小鼠的出血以及凝血方面上，除煎煮时间为180 min组之外，其他各给药组与空白组相对比小鼠的出、凝血时间均缩短，P＜0.01，差异有统计学价值。180 min组与空白组的对比，差异不具有统计学意义。结论 地黄煎煮液中梓醇的含量及其止血作用的变化情况随煎煮时间的长短变化而变化，并且影响很大。

【关键词】地黄；煎煮时间；梓醇含量变化；止血作用；对比研究

Objective To compare and analyze the dihuang decoction in different decocting time the content of catalpol changes and changes with thedecocting time of different hemostatic effect. Methods Different decocting time the content of catalpol was determined by high performance liquid chromatography（HPLC）was used to determine，and by cutting tail method and glass capillary tube method exploring different decocting time and their changes in hemostatic effect in mice. Will randomly selected 96 mice divided into 8 blank control group and radix rehmanniae decoction time were set for 15 min，30 min，45 min，60 min，90 min and 120 min and 180 min. After 1 weeks of continuous administration of mice，the bleeding time and clotting time of mice were measured by 40 min in eighth days. And comparative analysis of the results of each group. Results The changes of the contents of catalpol in rehmannia decoction with different decocting time and different，at the beginning of the catalpol content increased with the extension of the decocting time，decocting time for 60 min content reached the highest after catalpol content with the decocting time continues to lengthen decreased. In mice bleeding and coagulation aspects，in addition to decocting time 180 min group for each other to medicine group and blank group phase contrast to mice out，coagulation time were significantly shortened，P＜0.01，the difference has statistical value. The difference between the 180 min group and the blank group was not significant. Conclusion Dihuang decoction catalpol content and haemostatic effect changes with the decocting time and length of the changes，and has a great influence.

【Key words】 Rehmannia decoction，Time change，Catalpol content，Hemostasis，Comparative study

地黄为玄参科地黄属多年生草本植物，由于其块根颜色为黄白色而得名。其入药部位为根部。由于其炮制方法的不同，常分为鲜地黄以及干地黄和熟地黄三种［1］。梓醇具有抗炎止血功效。由于梓醇具有十分广泛的药理活性，因此对梓醇以及梓醇衍生物的研究成为广大研究者们的重点课题，研究的方向主要包括梓醇及其梓醇衍生物之间的化学转化，两者之间的药效学关系等［2］。为探究其在加工炮制过程中药理活性发生改变的内在机制，我们更应该将研究的重点放在梓醇以及梓醇降解后的生成物活性方面。梓醇更是地黄的主要药理活性成分，我们常常用梓醇含量的高低来判断地黄的质量及其药效，这是十分具有指导意义的。本研究旨在通过对比分析地黄煎煮液中不同煎煮时间里梓醇含量的变化情况，以及随煎煮时间的不同其止血作用的变化。研究其动态变化的同时，找到煎煮地黄的最佳时间，并探讨各因素之间的内在联系。以下是详细报道。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent1260高效液相色谱仪，超声波清洗器，电子天平。

1.2 试药

本次研究所用梓醇对照品由中国药品生物制品检定所提供，云南白药由云南白药集团股份有限公司提供，产品批号为20070801。本次研究所用试剂除乙腈为色谱纯外，其他均为分析纯。本次研究所用药材于陕西省万寿路药材市场购买，经陕西中医学院中药鉴定专家王继涛教授鉴定，为正品。

2 方法

2.1 梓醇的含量随煎煮时间不同的变化情况

2.1.1 样品制备 取7份地黄粗粉，每份各50 g，每份中加入8倍量的水，在浸泡30 min至浸泡透心后，分别煎煮15 min，30 min，45 min，60 min，90 min，120 min以及180 min。煎煮结束后，趁热将其过滤并收集滤液，之后将其浓缩后于100 ml量瓶中定容，并依次进行标记，得到样品。

2.1.2 梓醇含量的测定 （1）色谱条件：色谱柱：kromasil C18柱；流动相：乙腈-磷酸（1：99）；流速设定为1 ml/min；210 nm波长为检测波长；柱温为室温。（2）制备对照品溶液：取梓醇对照品适量，并进行精密称取，加入流动相，制成10.8 μg/ml的对照品溶液。（3）制备供试品溶液：取1 ml 2.1.1项下的样品，并将其分别至于蒸发皿中，蒸干后用甲醇溶液将残渣进行超声溶解，于25 ml量瓶中进行定容，摇匀后过滤，取续滤液即得。（4）测定：精密吸取10 μl对照品及供试品溶液，在高效液相色谱仪中进样，并记录峰面积。

2.2 止血作用的变化随煎煮时间不同的影响情况

稀释2.1.1项下的样品，制成符合该研究所用的浓度备用（1 ml相当于0.125 g原药材）。取96只昆明种小鼠，雌雄各一半，体重为（20±2）g，并将其科学的分为8组，每组含12只小鼠，空白组每天给予等体积的生理盐水，其余组每天按6.25 g/kg标准给药，连续给药1周，在第8 d早上对小鼠给药40 min后，分别测定各给药组小鼠的出血时间以及凝血时间。

2.2.1 测定凝血时间 从小鼠的左眼球后静脉丛处用玻璃毛细管取血，待血液注满后将其取出，平放在桌面上，在毛细管两端各折断0.5 cm，观察是否有凝丝出现，每30 s折一次。从血液流出毛细管时计时直至凝丝出现计时结束。此段时间为小鼠的凝血时间，取平均值并记录。

2.2.2 测定出血时间 将小鼠尾尖1 cm处用解剖剪横断，当血液溢出时，立即用滤纸吸血每30 s一次，直至血液自然停止流出，记录时间。

2.3 统计学方法

样品结果采用（均数±标准差）的方式表示，t检验用于数据分析比较，以P＜0.05差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 梓醇的含量随煎煮时间不同的变化情况

地黄煎煮液中梓醇含量的变化随煎煮时间的不同而不同，刚开始梓醇含量随煎煮时间的加长而升高，煎煮时间为60 min时含量达到最高；之后梓醇含量随煎煮时间的继续加长而降低。详情见表1。

3.2 止血作用的变化随煎煮时间不同的影响情况

表1 梓醇的含量随煎煮时间不同的变化情况

在小鼠的出血以及凝血方面的比较上，除煎煮时间为180 min组之外，其他各给药组与空白组相对比小鼠的出、凝血时间均有一定程度的缩短，P＜0.01，各组差异之间有统计学价值。180 min组与空白组的对比，差异不显著。详情见表2。

表2 止血作用的变化随煎煮时间不同的影响情况 （，n=12）

表2 止血作用的变化随煎煮时间不同的影响情况 （，n=12）

煎煮时间/min剂量/6.25 g/kg　凝血时间/s　出血时间/min空白15 30 45 60 90 120 180 -6.25 6.25 6.25 6.25 6.25 6.25 6.25 82.2±5.67 56.7±6.32 52.2±5.27 48.9±4.98 45.2±4.67 47.2±3.95 56.2±5.26 76.8±6.93 7.22±0.67 5.67±0.49 5.12±0.53 4.59±0.62 4.37±0.43 4.97±0.56 5.45±0.49 6.69±0.78

4 讨论

地黄为玄参科地黄属多年生草本植物，由于其块根颜色为黄白色而得名。其药用部位主要为根部。由于其炮制方法的不同，常将地黄分为鲜地黄以及干地黄和熟地黄三种。梓醇是地黄的主要药理活性成分，具有抗炎、抗癌、止血以及利尿等功效。梓醇的含量在鲜地黄中最高，经过一定的炮制过程后，梓醇含量往往会降低甚至消失。在我国，含有梓醇成分的植物种类非常多，在地黄中尤为突出，这为梓醇的进一步开发利用提供了坚实的资源保障。由于梓醇具有十分广泛的药理活性，因此对梓醇以及梓醇衍生物的研究成为广大研究者们的重点课题，研究的方向主要包括梓醇及其梓醇衍生物之间的化学转化，两者之间的药效学关系等。为探究在加工炮制地黄的过程中其药理活性改变的内在机制，我们更应该将研究的重点放在梓醇以及梓醇降解后的生成物活性方面，从而为临床开发新的有效地治疗药物提供一定的指导作用［2-4］。

在本研究中，我们通过对比分析了地黄煎煮液中不同煎煮时间里梓醇含量的变化情况，以及随煎煮时间的不同其对小鼠的止血作用的变化情况。在研究其动态变化的同时，找到煎煮地黄的最佳时间，并探讨了各因素之间的内在联系。研究结果表明，地黄煎煮液中梓醇含量的变化随煎煮时间的不同而不同，刚开始梓醇含量随煎煮时间的加长而升高，煎煮时间为60 min时含量达到最高；之后梓醇含量随煎煮时间的继续加长而呈逐渐降低状态。出现此现象的原因可能是由于梓醇为环烯醚萜苷类化合物，其热稳定性并不高。在地黄煎煮的过程中，随着煎煮时间的逐渐变长，使得梓醇成分慢慢挥发，从而导致含量越来越低。这一理论也为梓醇进一步的临床应用提供了可靠地理论基础［5-6］。另外，在小鼠的出血时间以及凝血时间方面的比较上，除煎煮时间为180 min组之外，其他各给药组与空白组相对比小鼠的出、凝血时间均有缩短，各给药组之间差异具有统计学意义，P＜0.01。但180 min组与空白组的对比，差异无统计学意义。这一研究结果表明，地黄的煎煮液具有一定程度的止血功效，并且其止血功效会随着地黄煎煮时间长短的不同而表现出一定的规律性。该规律可总结为：在一定的煎煮时间范围内，煎煮液的止血功效会随着煎煮时间的加长而增强；超过该煎煮时间范围后，煎煮液的止血功效反而会随着煎煮时间的加长而降低［7］。研究结果表明，当煎煮时间在45～90 min时，其煎煮液的止血效果最好。而在此煎煮时间内，煎煮液中的梓醇含量也是相对较高的。换句话说，即当煎煮液中梓醇的含量相对较高时其具有较好的止血作用，这也进一步说明了地黄的止血功效与其中所含的药理活性物质梓醇有关［8-9］。

综上所述，我们通过对比分析找到了煎煮地黄的最佳时间，并探讨了各因素之间的内在联系。本次研究的结果也表明，地黄煎煮液中梓醇含量的变化随煎煮时间的不同而不同，刚开始梓醇含量随煎煮时间的加长而升高，之后梓醇含量随煎煮时间的继续加长而呈逐渐降低状态。另外，在小鼠的出血时间以及凝血时间方面的比较上，其他各给药组也与空白组相对比小鼠的出、凝血时间也有十分显著的差异。由研究结果可知，在一定的煎煮时间范围内，煎煮液的止血功效会随着煎煮时间的加长而增强；超过该煎煮时间范围后，煎煮液的止血功效反而会随着煎煮时间的加长而降低。因此，当煎煮液中梓醇的含量相对较高时其具有较好的止血作用，这就说明了地黄的止血功效与其中所含的药理活性物质梓醇有关。我们通过探讨煎煮时间对煎煮液中梓醇含量的变化影响，对比分析不同煎煮时间下煎煮液对小鼠的止血功效可知，不仅梓醇含量的高低受到煎煮时间很大的影响，止血作用的强度也受煎煮时间很大的影响［10-11］。该变化规律有利于对地黄的研究，更为阐述地黄具有凉血作用的药效物质及其作用机制提供了很大的指导作用，为其在临床上的进一步应用奠定了理论基础。

参考文献

［1］ 廉江平，廖建民，张鹏，等. 地黄饮湿法提取与煎煮法提取效率的比较［J］. 光谱实验室，2012，29（4）：2519-2522.

［2］ 张永宁，袁丽超，佟书娟，等. 二至丸、地黄煎影响小鼠免疫功能的比较研究［J］. 中国实验方剂学杂志，2012，18（8）：159-162.

［3］ 袁婷，高雅楠，王任，等. 二仙汤、二至丸和地黄煎对小鼠脾细胞和卵巢颗粒细胞的调节作用［J］. 上海中医药杂志，2014，48 （10）：89-92.

［4］ 奚香君，张永宁，袁丽超，等. 香菇多糖、地黄煎影响小鼠免疫及内分泌功能的比较研究［J］. 辽宁中医药大学学报，2013，15 （2）：50-52.

［5］ 于生，陈星，单鸣秋. 紫菀丸对血热出血大鼠血液流变性、凝血时间及肺部的影响［J］. 中国实验方剂学杂志，2013，19（13）：229-233.

［6］ 柳佳，张丽，丁安伟，等. 基于中医辨证用药特点建立大鼠血热出血模型［J］. 中国药理学通报，2012，28（9）：1319-1324.

［7］ 贾秀梅，张振凌，吴瑞环. 鲜地黄及保鲜加工品对血热出血模型大鼠凉血止血药效比较［J］. 中国实验方剂学杂志，2014，20（6）：127-132.

［8］ 吉雪琪，孙鹏，祁建军，等. 地黄生长期根叶中梓醇及总环烯醚萜苷含量变化［J］. 中国中药杂志，2014，39（3）：466-470.

［9］ 刘峰，张恒，李静，等. 地黄中梓醇的变化条件研究［J］. 中医药信息，2014，31（1）：10-13.

［10］ 许继承，高明波，王婷，等. HPLC测定地黄叶与生地、熟地中梓醇含量［J］. 广州化工，2015，43（12）：104-105，155.

［11］ 熊辉，朱军，陈琴华. 地黄不同提取工艺中梓醇含量的比较［J］.中国医院药学杂志，2015，35（17）：1610-1612.

【中图分类号】R242

【文献标识码】A

【文章编号】1674-9316（2016）10-0134-03

doi:10.3969/j.issn.1674-9316.2016.10.095

作者单位：滨州市无棣县人民医院药剂科，山东 滨州 251900

The Comparative Study of Dynamic Change Regularity of Catalpol in Different Time and Decoction of Rehmannia Decoction Process and Its Hemostatic Effect

YANG Bingchen Pharmacy Department，People's Hospital Wuli Country，Binzhou Shandong 251900，China

【Abstract】