新加达原饮对慢性乙型肝炎患者外周血树突状细胞的影响

王礼凤 宋春蓉 曹宁 齐婧 鱼富丽 郑旭锐 惠毅

摘要：目的 观察新加达原饮对慢性乙型肝炎（CHB）患者外周血树突状细胞（DCs）的影响。方法 对20例CHB患者均给予新加达原饮治疗，疗程12周。于治疗前及治疗4、8、12周时采集抗凝外周静脉血，分离扩增单个核细胞中DC，流式细胞法检测DC表型，同步检测患者丙氨酸氨基转移酶（ALT）及HBV DNA水平，并以10例健康人作为正常对照。结果 与正常对照组比较，CHB患者外周血DCs表面CD80、CD86、CD-1α、HLA-DR表达显著下降（P<0.01）。经新加达原饮治疗后，DCs表面分子表达水平均提高，在治疗12周时最显著（P<0.01）。与治疗前比较，CHB患者治疗后ALT升高，于治疗8周时最显著（P<0.01），治疗12周时明显下降（P<0.01）；HBV-DNA水平下降，治疗12周时下降最显著（P<0.01）。结论 CHB患者外周血DCs表面分子表达水平低下，新加达原饮能上调DC表型表达。

关键词：慢性乙型肝炎；新加达原饮；树突状细胞

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.08.007

中图分类号：R259.126.2 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2016）08-0024-04

乙型肝炎是由乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）引起的，以肝脏炎性病变为主的一种传染性疾

基金项目：陕西省中医管理局中医药科研课题（13-LC074）

病，宿主免疫状态是决定乙型肝炎临床转归和疗效的最主要因素[1]。近年来国内外研究提示，造成慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）感染慢性化的机制与机体内树突状细胞（DCs）抗原递呈功能缺陷，不能把病毒抗原的信号传递给机体的免疫系统有关[2-6]。新加达原饮是在明代医家吴又可创立的达原饮基础上，经过长期临床实践加减变化组成的经验方，对CHB具有较好治疗效果[7-9]。本研究以3个月为1个疗程，观察其对CHB患者外周血DCs的影响。现报道如下。

1 临床资料

1.1 一般资料

20例均为2013年7月-2014年12月陕西中医药大学第一附属医院门诊患者。其中男14例，女6例，年龄20～54岁，平均年龄（32.4±10.2）岁，病程2～21年。另以10例健康人作为正常对照，均为陕西中医药大学第一附属医院职工。本研究经医学伦理委员会批准。

1.2 诊断标准

CHB诊断依据2010年中华医学会感染病学分会、肝病学分会联合制定的《慢性乙型肝炎防治指南》的诊断标准[10]。

1.3 纳入标准

符合上述CHB诊断标准，半年内未服用任何抗病毒药物和免疫调节剂治疗，且不属于排除标准任何一项的病例。

1.4 排除标准

血清胆红素≥34.2 ?mol/L；ALT>400 U/L；血清白蛋白≤30 g/L；重叠感染其他肝炎病毒（如甲、丙、丁、戊型肝炎病毒等），合并肝硬化、肝癌、脂肪肝；合并心脑、肺、肾等器质性疾病及造血系统严重疾病、精神病患者；年龄>65岁或<18岁妊娠或哺乳期妇女；未按规定服药者。

2 方法

2.1 治疗药物

所有患者均服用新加达原饮散剂（草果6 g，槟榔10 g，黄芩15 g，白芍12 g，厚朴10 g，柴胡15 g，丹参20 g，姜黄10 g，叶下珠15 g，僵蚕10 g，蝉蜕10 g，灵芝10 g等，药物饮片均购自北京同仁堂，经陕西中医药大学制药厂净化烘焙处理后，制成散剂），5 g，口服，每日3次。连续治疗12周为1个疗程。治疗期间禁止服用任何其他抗病毒药物和保肝降酶药物。

2.2 主要试剂

淋巴细胞分离液，上海博升公司，批号20140506；重组人白细胞介素4（rh IL-4），美国Peprotech公司，批号20131103；重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（rh GM-CSF），美国 Peprotech公司，批号20131217；RPMI-1640，吉诺生物医药技术有限公司；10%胎牛血清（fetal calf serum，FCS），美国Hyclone公司，批号20140123；荧光标记鼠抗人HLA-DR-PE（藻红蛋白荧光素，批号20131220）、CD80-FITC（异硫氰酸荧光素，批号20131125）、CD86-PE（批号20131214）、CD1a-FITC（批号20140210），美国 ebioscience公司；磷酸盐缓冲液（PBS），江苏宝莱公司，批号20140312；噻唑兰（MTT，批号20131015）、二甲基亚砜（DMSO，批号20130925），美国Sigma公司。

2.3 观察指标

于治疗前及治疗4、8、12周时，检测患者肝功能指标丙氨酸氨基转移酶（ALT），荧光PCR法检测HBV-DNA水平，流式细胞仪检测CD80、CD86、HLA-DR、CD-1α。

2.4 树突状细胞培养及表型检测

参照Romani等[11]分离培养DCs的方法稍作修改。无菌条件下抽取人外周血20 mL，肝素抗凝，用淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs），PBS洗涤2次，RPMI1640洗涤1次。用含10% FCS RPMI 1640液调整外周血PBMCs浓度为3×106/mL，移植入6孔培养板，每孔3 mL。37 ℃、5%CO2条件下培养2 h，吸弃培养上清液，37 ℃预热RPMI 1640液轻轻洗涤培养板2次，去除非贴壁细胞，即获得贴壁的单个核细胞。向去除非贴壁细胞的6孔培养板每孔内各加10% FCS RPMI 1640培养液3 mL，其中含有GM-CSF 100 ?g/L、IL-4 500 U/mL，在37 ℃、5%CO2条件下培养，隔日换液1次，吸弃原液1.5 mL，加同体系培养液1.5 mL。收集第7日悬浮细胞，即为DCs，用PBS洗细胞2次，稀释成5×105/ml，加入鼠抗人CD80-FITC、CD86-PE、HLA-DR-PE、CD-1α-FITC各20 ?L，轻轻混匀，4 ℃温育45 min，再用PBS洗2次，流式细胞仪检测DCs的表达。

2.5 统计学方法

采用SPSS12.0统计软件进行分析。计量资料用 —x±s表示，组间均数比较采用方差分析，治疗前后均数比较采用t检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

3 结果

3.1 治疗前后患者肝功能及乙型肝炎病毒DNA比较

治疗过程中，CHB患者ALT一度升高，于治疗8周时升高明显，但随治疗时间延长逐渐下降，于治疗12周时基本恢复正常。治疗后患者HBV-DNA水平下降。结果见表1。

3.2 正常对照组与慢性乙型肝炎患者治疗前后树突状细胞表型表达比较

与正常对照组比较，CHB患者组外周血DCs表面CD80、CD86、CD-1α、HLA-DR的表达水平显著下降（P<0.01）。给予新加达原饮治疗后，CHB患者组外周血DCs表面CD80、CD86、CD-1α、HLA-DR的表达水平均升高，且在治疗12周时最显著（P<0.01）。结果见表2。

4 讨论

DC是起源于骨髓的专职抗原递呈细胞（antigen presenting cell，APC），具有启动T细胞介导的免疫应答功能，其功能状态直接影响细胞和体液免疫应答。DC也是唯一可激活初始型免疫反应的细胞，是最强大的次级免疫反应的诱导物，是免疫应答的始动者。研究表明，CHB患者存在DC功能缺陷。HBV及其抗原可造成DC数量、表型和功能的异常[5，12]。CHB患者体内DC细胞功能缺陷，使HBV病毒粒子和抗原成分直接抑制DC细胞的表型成熟和功能活化，从而使DC细胞不能有效递呈HBV抗原给T淋巴细胞[13]。对慢性HBV感染者的研究也发现，感染者外周血DC表面的CD1α、HLA-DR、CD80和CD86的表达水平低于健康者[14]。

中医关于CHB发病机制正邪关系的论述，与现代医学关于HBV感染造成机体免疫功能损伤，致病毒持续不能得到清除以使乙肝慢性化甚至导致肝硬化、肝癌发生的机制不谋而合。中医认为HBV属外感邪气，从HBV引起急慢性肝炎的临床表现来看，HBV同时具有湿、热、毒邪的特点。HBV侵犯人体后，湿热疫毒之邪蕴结中焦，影响肝胆脾胃的正常生理功能，致使脾胃失健、肝郁气滞。日久邪气结而不去，由气入血，病久入肾，造成瘀血内停，肝脾肾亏损。脾为后天之本，肾为先天之本，是人体正气的源泉和根本。HBV感染后虚实夹杂，湿、热、毒、瘀互结，邪盛不断伤正，正虚不能驱邪外出，形成恶性循环，遂致病情迁延难愈。新加达原饮正是基于这样的病因病机认识创立的有效方剂，始终坚持扶正以助祛邪，祛邪不忘扶正，全面激发机体免疫应答发挥抗病毒作用。本研究发现，与正常对照组比较，CHB患者外周血DCs表面CD80、CD86、CD-1α、HLA-DR的表达显著下降，经新加达原饮治疗3个月，可以使患者DCs表面分子表达水平显著提高。

研究中我们还观察到，20例患者中有5例在开始治疗时无任何症状，具有不同程度消化道症状者12例，仅感腰部酸困、失眠者3例。治疗4周时，腰酸及失眠者症状消失，其他患者症状改善不明显。在治疗8周时，有8例患者诉纳差加重，但随着治疗时间的延长，症状逐渐减轻；原来5例无症状患者中有4例在治疗4周时出现大便溏、轻度腹胀，在治疗8周时症状明显，随着治疗时间的延长，症状减轻，至12周疗程结束，所有患者症状基本消失。患者肝功能指标（ALT）在开始治疗后均升高，但病毒水平并未出现相应增长，而是持续降低；随着治疗时间的延长，ALT逐渐恢复正常，此时病毒量进一步下降。在这一过程中并未增加任何保肝措施，由此推测，药物通过上调DCs的功能，激发机体免疫应答，增强了机体正气祛邪外出的能力，从而使湿热伏邪不断透出，引起或加重腹胀、便溏、纳差等症状表现；同时发挥了抗病毒的作用，进而使肝细胞在病毒清除过程中暂时受到损害而致肝功能异常。

总之，新加达原饮可以通过增强DCs的功能而发挥抗HBV的作用，可以用于CHB的治疗。本研究由于经费有限，观察周期较短，尚无法全面揭示其抗病毒机制。在通过激发免疫应答彻底清除乙肝病毒这一治疗过程中，免疫清除的重要标志——转氨酶升高[15]是判断疗效和预后的重要指标。如何控制肝功能的异常程度即ALT升高的水平，才更加有利于抗病毒，获得完全应答，还需要更多的研究来确定，以防止发生肝功能失代偿现象。

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