木榄提取物及单体化合物对SH-SY5Y神经细胞抗氧化研究

周　媛　薛艳红　刘朝霞

(1. 西安外事学院 医学院， 西安　710077； 2. 天然产物研究与利用湖北省重点实验室(三峡大学)， 湖北 宜昌　443002)



木榄提取物及单体化合物对SH-SY5Y神经细胞抗氧化研究

周媛1，2薛艳红2刘朝霞2

(1. 西安外事学院 医学院， 西安710077； 2. 天然产物研究与利用湖北省重点实验室(三峡大学)， 湖北 宜昌443002)

摘要：研究了中国海南红树植物木榄提取物及其单体化合物对SH-SY5Y神经细胞的抗氧化作用．对木榄成分提取分离、结构鉴定后，用H2O2处理人神经瘤母细胞(SH-SY5Y细胞)，建立细胞损伤模型，以MTT法检测木榄提取物及单体化合物的细胞增殖作用与抗氧化活性．结果表明木榄乙醇提取物、石油醚萃取部位、乙酸乙酯萃取部位及部分单体化合物能很好地对抗H2O2诱导的SH-SY5Y细胞损伤．单体化合物在低剂量(1.25～5 μg·mL-1)时量效关系良好，随着浓度的增加，对SH-SY5Y细胞的抗氧化作用逐渐增强．木榄能能很好地对抗H2O2诱导的SH-SY5Y细胞损伤，对SH-SY5Y细胞具有显著的抗氧化作用，该作用与减少胞内氧自由基有关，其机制有待进一步研究．

关键词：木榄；SH-SY5Y细胞；H2O2；抗氧化

木榄Bruguieragymnorhiza(L.) Savigny，为红树科(Rhizophoraceae)木榄属(BruguieraLamk)植物．木榄生长于海岸冲积带的红树林中，国内外均有分布．我国广东、广西、福建、台湾等省及其沿海岛屿为国内主要分布地．木榄作为海洋药用植物，已收载于《台湾药用植物志》、《海洋药物》、《现代本草纲目》等中草药专著中[1]．民族药理学认为木榄具有清热解毒、止泻、收敛、止血及截疟等功效．但木榄对神经细胞的抗氧化作用方面的研究迄今为止未见相关报道．

1材料与方法

1.1试验药物

木榄，2009年10月采自中国海南岛，由中国暨南大学药学院吴军教授鉴定为红树科木榄属植物木榄Bruguieragymnorhiza(L.) Savigny．原植物标本存放于天然产物研究与利用湖北省重点实验室(三峡大学)，样品编号为BGSANYA200910．木榄(12 kg)，自然干燥，粉碎，室温下以95%乙醇浸提5次，提取液浓缩得浸膏(0.5 kg)．不同极性有机溶剂萃取，得石油醚部位22.5 g，乙酸乙酯部位20.0 g，正丁醇部位125.0 g．石油醚部位和乙酸乙酯部位通过各种柱层析并结合HPLC分离纯化，得到单体化合物：油酸(BGP-1)、β-谷甾醇(BGP-2)、大黄素甲醚(BGP-3)、Mansonone H(BGP-4)、脑苷脂B(BGP-5)、Populene A(BGP-10)、3，4，5-三甲氧基苯甲酸(BGE-3a)和3，4-二甲氧基苯甲酸(BGE-3b)、咖啡酸(BGE-9)、大黄酸(BGE-10)，均为已知化合物，其光谱数据与文献报道一致．各萃取部位及单体化合物以DMSO/无水乙醇混合溶液溶解，制成储备液，0.22 μm滤器过滤除菌，4℃保存．临用时以DMEM/F-12给药培养基稀释成所需浓度，并使DMSO终浓度不超过0.1%，无水乙醇终浓度不超过1%．

1.2细胞株

人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y系(华中科技大学实验动物中心提供，三峡大学天然产物研究与利用湖北省重点实验室传代保藏)．

1.3试剂

DMEM/F-12培养基，上海沪鼎生物科技有限公司；胰蛋白酶，赛默飞世尔科技(中国)有限公司；MTT、DMSO，美国Sigma公司；新生胎牛血清，浙江天杭生物科技有限公司；青霉素、链霉素，华北制药集团公司；NaCl、KCl、Na2HPO4·12H2O、KH2PO4、NaHCO3、H2O2等，北京双鹤现代医药技术有限公司．

1.4培养基及试液配制

DMEM/F-12培养基配制：DMEM/F-12培养基粉末1包，溶于950 mL重蒸馏水中，混匀，加2.2 g NaHCO3，溶解后加重蒸馏水定容至1 000 mL，用0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，分装，于4℃保存．

DMEM/F-12完全培养基配制：DMEM/F-12培养基中加入100 U·mL-1链霉素，100 U·mL-1青霉素，10%新生胎牛血清．

DMEM/F-12给药培养基配制：DMEM/F-12培养基中加入100 U·mL-1链霉素，100 U·mL-1青霉素，3%新生胎牛血清．

DMEM/F-12造模培养基：DMEM/F-12培养基中加入100 U·mL-1链霉素，100 U·mL-1青霉素．

0.01 mol·L-1PBS溶液：精密称取NaCl 8.00 g，KCl 0.20 g，Na2HPO4 2.89 g，KH2PO40.20 g，加重蒸馏水溶解，滴加1 mol·L-1盐酸调节溶液pH值为6.8～7.0，加重蒸馏水定容至1 000 mL，分装，121℃灭菌30 min，冷却后于4℃保存．

青/链霉素溶液：取青霉素(80万单位/瓶)1瓶，链霉素(100万单位/瓶)1瓶，分别用注射器加入重蒸馏水溶解使成每毫升各含20万单位的溶液．分取4 mL青霉素溶液和4 mL链霉素溶液置盛有32 mL重蒸馏水的烧杯中，混匀配制成2万单位/mL的青/链霉素溶液，经0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，分装，于-20℃保存．临用时按每100 mL培养基加0.5 mL青/链霉素溶液的比例使用．

MTT溶液：精密称取MTT粉末0.250 g，加入到45 mL 0.01 mol·L-1PBS溶液中，溶解，混匀，加0.01 mol·L-1PBS溶液定容至50 mL，经0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，分装，于4℃避光保存．

0.25%胰酶溶液：精密称取胰酶0.250 g，加90 mL 0.01 mol·L-1的PBS充分溶解后定容至100 mL，经0.22 μm滤膜过滤除菌，分装，-20℃保存．

H2O2溶液：取市售30% H2O212 μL加入到1 mL双蒸水中配制成100 mmol·L-1的储液，0.22 μm微孔滤器过滤除菌，然后用DMEM/F-12造模培养基稀释至所需浓度，现配现用．

1.5方法

1.5.1SH-SY5Y细胞培养

37℃、5%CO2、饱和湿度孵育箱中，以DMEM/F-12完全培养基培养．待SH-SY5Y细胞生长至80%～90%汇合时进行传代，传代比例为1∶3，用0.25%胰蛋白酶消化贴壁细胞．

1.5.2H2O2损伤模型建立与细胞增殖活性筛选[1]

取对数生长期的SH-SY5Y细胞接种于96孔板，接种浓度5×104个/mL，每孔100 μL．培养24 h贴壁后弃去旧培养基，加入不同浓度的试验药物，同时设空白组和模型组，空白组、模型组加入DMEM/F-12溶药培养基，每组设5个复孔，继续培养24 h，弃去旧培养基，空白对照组加入DMEM/F-12造模培养基，模型组、给药组加入H2O2溶液，继续培养12 h，MTT比色法于492 nm波长处测定吸光度值，计算细胞存活率．

1.5.3单体化合物对SH-SY5Y细胞存活率量效关系实验[2-4]

照“1.5.2”方法用H2O2造模，加入对神经细胞抗氧化作用显著的木榄单体化合物BGP-1、BGP-3、BGP-4、BGP-5、BGE-9及BGE-10，浓度分别设置为1.25，2.50，5.00，10.00，20.00 μg·mL-1，MTT比色法检测化合物对SH-SY5Y细胞存活率的影响，考察其量效关系．

1.5.4统计学处理

采用SPSS13.0统计软件进行统计分析，实验数据以x±s表示．

2结果

2.1木榄及单体化合物对H2O2损伤下SH-SY5Y细胞的增殖作用

为明确木榄及其单体化合物对SH-SY5Y神经细胞的生长是否具有毒害作用，并确定适宜的药物浓度范围，试验中考察了高低两种浓度(30 μg·mL-1与3 μg·mL-1)对SH-SY5Y细胞存活率的影响．初筛结果显示，与模型组相比，木榄乙醇提取物、石油醚萃取部位、乙酸乙酯萃取部位、单体化合物(BGP-1、BGP-3、BGP-4、BGP-5、BGP-10、BGE-9、BGE-10、BGE-3a)均能提高细胞存活率，提取物中以乙醇提取物及石油醚萃取物增殖活性更好，单体化合物中以BGP-1、BGP-3、BGP-4、BGP-5、BGE-9及BGE-10增殖效果更好，表明木榄在一定程度上保护细胞免于遭到双氧水的氧化损伤，具有明显的对神经细胞的抗氧化作用．见表1和表2．

表1　各提取物对H2O2致神经细胞损伤的影响

续表1　各提取物对H2O2致神经细胞损伤的影响±s，n=6)

注：各提取物的药量根据得率折算成原生药为40、80 g·kg-1．

表2　单体化合物对H2O2致神经细胞损伤的影响±s，n=8)

注：与模型组相比*P<0.05，**P<0.01．

2.2单体化合物对H2O2损伤下SH-SY5Y细胞抗氧化的量效关系

木榄单体化合物对神经细胞抗氧化的量效关系结果见表3．从结果可看出，BGP-1、BGP-3、BGP-4、BGP-5、BGE-9及BGE-10这6种单体化合物对神经细胞的保护作用趋势，与“2.1”结果一致．BGP-5能很好地对抗H2O2诱导的SH-SY5Y细胞损伤，效果显著，细胞存活率可达100%左右，接近空白组．进一步分析发现，各化合物的量效关系并不具一致的规律性，仅BGP-3随着浓度的增加，其抗氧化活性亦增加；但在较低浓度(1.25～5 μg/mL)时，多表现出良好的剂量依赖关系，即抗氧化作用随药物浓度增加而增强；高剂量时各化合物对抗H2O2诱导的SH-SY5Y细胞损伤的作用不再增强．

表3　药物对H2O2致神经细胞损伤的影响

注：与模型组相比*P<0.05，**P<0.01．

3讨论

在神经系统疾病的发生中，氧化应激是重要的致病因素[5]．目前评价最多的神经保护药物是电压和受体介导的钙通道拮抗剂和直接抑制氧自由基介导细胞损伤的抗氧化剂[6]．本文采用MTT法，用H2O2处理SH-SY5Y细胞，建立细胞损伤模型，筛选木榄提取物及单体化合物对SH-SY5Y神经细胞的抗氧化作用，发现木榄的乙醇提取物、石油醚萃取部位、乙酸乙酯萃取部位及部分单体化合物能很好地对抗H2O2诱导的SH-SY5Y细胞损伤，提高细胞存活率．特别是BGP-5，与模型组相比，在剂量为1.25～10.00 μg·mL-1(1.48～11.86 μmol·L-1)时，细胞存活率提高了约100%，表明随着药物浓度的增加，其对神经细胞的抗氧化作用逐渐增强．在较低浓度(1.25～5 μg·mL-1)时，单体化合物多表现出良好的剂量依赖关系，即抗氧化作用随药物浓度增加而增强具有良好的量效关系，但高剂量时化合物对抗H2O2诱导的SH-SY5Y细胞损伤的作用不再增强．木榄对神经细胞的抗氧化作用与减少胞内氧自由基有关，其机制可能与升高抗氧化物酶或降低炎性介质有关．其具体机制有待进一步研究．

参考文献：

[1]曾文，毕玉婷，孔玉珊，等．吉祥草中5种提取物对神经细胞的抗氧化活性研究[J]．时珍国医国药，2014(7)：1549-1551．

[2]吴迪，吴桂荣，阿布力孜·阿布杜拉，等．不同-3/-6构成比的配伍红花籽油对SH-SY5Y细胞氧化损伤的预防效应[J]．天然产物研究与开发，2011(3)：420-422．

[3]孙芳玲，王文，安宜，等．莫诺苷抑制过氧化氢诱导的神经细胞损伤作用[J]．中国药物与临床，2008(11)：843-845．

[4]余涓，胡桂芳，翁绳美，等．13-甲基十四烷酸对H2O2诱导SH-SY5Y神经细胞损伤的保护作用[J]．中国临床药理学与治疗学，2010(6)：622-626．

[5]马丽君，曹池，田建英，等．维生素E对神经细胞氧化应激损伤的保护作用[J]．宁夏医科大学学报，2012(8)：768-770．

[6]钟广英，付晓珍，张叶军，等．植物多糖对神经细胞的保护作用[J]．生物技术通讯，2014(6)：893-895．

[责任编辑周文凯]

收稿日期：2015-12-16

基金项目：国家自然科学基金项目(31540065)；天然产物研究与利用湖北省重点实验室开放基金(2015NP03)；三峡大学人才启动基金项目(KJ2009B001)

通信作者：刘朝霞(1977-)，女，副教授，博士，研究方向天然产物开发与活性研究．E-mail： bosliu2009@163.com

DOI：10.13393/j.cnki.issn.1672-948X.2016.02.020

中图分类号：

文献标识码：A

文章编号：1672-948X(2016)02-0088-04

Antioxidation ofBruguieraGymnorrhizaExtracts and Its Compounds on SH-SY5Y Cells

Zhou Yuan1,2Xue Yanhong2Liu Zhaoxia2

(1. Medical College, Xi'an International Univ., Xi'an 710077, China；2. Hubei Key Laboratory of Natural Products Research & Development, China Three Gorges Univ., Yichang 443002, China)

AbstractTo investigate antioxidation of the Chinese Hainan mangrove plant，Bruguiera gymnorrhiza, the compounds were isolated and purified with silica column chromatography and sephadex LH-20 column chromatography and HPLC methods. Their structures were identified by physicochemical analysis，spectroscopic analysis (1H-NMR，13C-NMR and MS). After extraction and purification，H2O2 oxidative damage model to human neuroblastoma strains SH-SY5Y cells was established; and then the cell toxicity and the antioxidation under oxidative stress were evaluated by MTT method． The ethanol extract, petroleum ether extract and ethyl acetate extract of B. gymnorrhiza showed better antioxidant activities for SH-SY5Y cells. Among the compounds oleic acid (BGP-1), physcion (BGP-3), Mansonone H (BGP-4), Catacerebroside B (BGP-5), caffeic acid (BGE-9) and rhein (BGE-10) had more significant protective effects and showed the dose-dependent effect at the low concentrations (1.25-5 μg/mL). It is concluded that the B. gymnorrhiza can be developed as a potential drug for neurodegenerative diseases．

KeywordsB. gymnorhiza;SH-SY5Y cell;H2O2;antioxidation