75例血友病A患者内含子22及1基因倒位情况分析*

黄吉娥, 张　婧, 刘咏梅, 杨　芳, 曾小菁*

(1.贵州医科大学附院， 贵州 贵阳　550004； 2.贵州省肿瘤医院， 贵州 贵阳　550004； 3.贵州医科大学， 贵州 贵阳　550004)



75例血友病A患者内含子22及1基因倒位情况分析*

黄吉娥1, 张婧2, 刘咏梅1, 杨芳3, 曾小菁1*

(1.贵州医科大学附院， 贵州 贵阳550004； 2.贵州省肿瘤医院， 贵州 贵阳550004； 3.贵州医科大学， 贵州 贵阳550004)

[摘要]目的： 观察血友病A(HA)患者凝血因子Ⅷ(FⅧ)基因内含子22倒位和内含子1倒位情况。方法: 取75例HA患者静脉血，采用长距离PCR扩增技术(LD-PCR)检测内含子22和内含子1倒位情况, 观察两种内含子倒位发生率，同时观察内含子22倒位在重型HA中的比例，比较有家族史和无家族史HA患者内含子22倒位发生率。结果: 检出22号内含子倒位患者27例，检出率36%(27/75)，全部为HA重型患者，占重型血友病A患者的57.4%(27/47)；27例中有21例有家族史，有家族史患者内含子22号倒位的发生率高于无家族史患者(P<0.05)；检出内含子1倒位1例，占1.3%(1/75)。结论： FⅧ基因内含子22倒位患者患重型HA的几率较高，内含子22倒位检测在重型HA的基因诊断中具有重要意义。

[关键词]血友病A； 凝血因子Ⅷ； 基因倒位； 诊断

血友病A(hemophilia A，HA)是一种由凝血因子Ⅷ(FⅧ)基因缺陷所致的X 连锁遗传性出血疾病, 男性患病率约为1/5 000。HA患者常出现自发性或外伤后出血不止, 严重威胁着患者的生命, 给患者家庭和社会带来沉重的负担[1]。为阻断致病基因传递,防止新的HA患儿出生, 开展HA携带者检测和产前诊断,对于降低HA的发病率和致残率具有重要意义。FⅧ基因内含子22和1倒位是导致重型HA的重要的分子发病机制，内含子22和1倒位分析也是目前用于HA疾病基因诊断的主要技术[2]。本研究通过长距离PCR扩增技术(long distance-PCR,LD-PCR)检测HA患者内含子22和1倒位情况，以期提高检测预判的成功率及稳定性,进而成熟应用于地区HA家系及携带者调查。

1材料和方法

1.1研究对象

病例均选自血友病中心2012-2014年登记的HA患者75例，均为男性，年龄9个月～58岁(≤10岁者19例，11～30岁41例，>30岁患者15例)；有家族史者46例，无家族史者29例；根据FⅧ活性，分为轻、中、重型，重型患者47例(FⅧ活性<1%)，中间型患者24例(FⅧ活性1%～5%)，轻型患者4例(FⅧ活性>5%～40%)，血管性血友病因子(vWF)抗原正常，均符合张之南等[3]主编的第3版《血液病诊断及疗效标准》HA的诊断标准。

1.2标本采集与处理

取静脉血3 mL，用EDTA-Na2抗凝，充分混匀。血样采集后1 h内将标本在室温下以3 000 r/min离心5 min，取血浆层、白细胞层和红细胞层分装于已消毒的EP管中，储存于-80 ℃冰箱内。使用经典的酚-氯仿法提取DNA。

1.3内含子22基因倒位的检测

以FⅧ基因DNA序列(GeneBank参考序列：CM000685.2)为模板，应用软件Primer 5设计引物，见表1。LD-PCR反应体系为 2×GC PCR 缓冲液 I 12.5μL , dNTP(2.5μmol，dGTP/7-deaza-dGTP=3/1)4 μL,引物P、Q、B (10μmol/L) 分别1、0.5、0.5 μL,模板基因组DNA 1 μL (约100 ng) , LA-Taq酶0.25 μL, 蒸馏水补足至25 μL；反应条件98 ℃预变性1 min,98 ℃变性10 s,68 ℃退火(延伸)10 min,10个循环后，98 ℃变性10 s,每一个循环的68 ℃退火(延伸)20 s，20个循环中,最后一次72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。扩增产物检测：取PCR扩增产物5 μL，与1 μL 6×上样缓冲液混匀，在0.6%琼脂糖凝胶(含0.5 m/L溴化乙锭)，1×TBE缓冲液的电泳槽中，恒压50 V的电压下电泳5 h，置凝胶成像系统观察结果。

表1　内含子22倒位检测所需引物序列及扩增片段长度

1.4内含子1基因倒位的检测

双管多重PCR反应包括Int1h-1和Int1h-2两个体系，相关引物设计参照文献[6]。内含子1倒位反应引物序列及片段大小见表2。Int1h-1反应体系： 10×LA 缓冲液Ⅱ(含Mg2+)2.5 μL,dNTP混合液2 μL,引物9F(10 μmol)、引物int1h-2F(10 μmol)、引物9CR(10 μmol)各1 μL,模板基因组DNA 2 μL (约200 ng),LA-Taq酶0.25 μL, 蒸馏水补足至25 μL；Int1h-2反应体系：10×LA缓冲液Ⅱ(Mg2+plus)2.5 μL,dNTP Mixture 2 μL,引物9F(10 μmol)、引物int1h-2F(10 μmol)、引物int1h-2R(10 μmol)各1 μL ,模板基因组DNA 2 μL (约200 ng),LA-Taq酶0.25 μL,蒸馏水补足至25 μL；反应条件94 ℃预变性5 min,94 ℃变性10 s,61 ℃退火30 s，

表2　内含子1倒位检测所需引物序列及扩增片段长度

72 ℃延伸2 min,共30个循环后，最后一次72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。扩增产物检测：1.5%琼脂糖凝胶，5 μL PCR产物加1 μL 6×上样缓冲液产物混合上样，DNA Marker为DL2000，在0.5×TBE电泳液中在恒压100 V条件下电泳1 h，紫外灯下凝胶成像处理。

1.5统计学方法

采用SPSS 18.0软件进行统计学分析，采用χ2检验确切概率法进行分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1FⅧ基因内含子22倒位分析

75例HA患者中内含子22倒位患者27例，占36%,27例患者均为重型，占重型HA的57.4%(27/47)。FⅧ基因内含子22倒位的LD-PCR产物为11 kb，电泳结果见图1。

注：M1及M2为 DNA Marker，N为正常对照，1、4、5、7、9、10可见11 kb条带，提示存在内含子22倒位，2、3、6、8、11及N可见12 kb条带，提示为正常图1　HA患者及正常对照标本FⅧ基因内含子22倒位LD-PCR电泳结果Fig.1　F VIII intron 22LD-PCR electrophoresis results for HA patients and normal controls

2.2FⅧ基因内含子1倒位分析

根据扩增产物的片段长度进行判断内含子1的倒位情况，75例HA患者中发现1例内含子1倒位，占1.3%(1/75)，电泳结果见图2。HA患者内含子22倒位发生率36%高于内含子1倒位发生率(1.33%)，两者比较差异具统计学意义(P<0.05)。

注：M1及M2为 DNA Marker， 2为1号内含子倒位HA患者标本；标本1，3为正常人图2　HA患者及正常对照标本FⅧ基因内含子1倒位PCR扩增结果Fig.2　The PCR amplification results of FVIII intron 1 for HA patients and normal control specimens

2.3有、无家族史HA患者内含子22倒位发生率

27例检测出内含子22倒位的患者中21例有较明确的家族史，6例无家族史，有家族史HA患者中内含子22倒位发生率及重型血友病患者的比例均高于无家族史患者(P<0.05)。见表3。

3讨论

HA是由于FⅧ基因缺陷导致的一种临床上最常见的遗传性出血性疾病,FⅧ基因约186 kb,包括26个外显子和25个内含子,其中内含子22最大，长达32 kb,为最大的内含子。导致HA的基因突变原因繁多,且有高度异质性,其中重型HA 基因突变多为大的DNA片段缺失、倒位或插入等。1993年Lakich证实了40%～50%的重型HA为内含子22 倒位所致,发生机制为FⅧ基因内存在一个基因FⅧA ,长达9.5 kb,与FⅧ基因转录方向相反,在FⅧ基因外上游约400 kb处有两个与FⅧA 高度同源的核苷酸序列(具99.99 %同源性) FⅧA1,FⅧA2。FⅧA与其同源序列发生重组时就形成内含子22倒位,使1～22号外显子与22～26号外显子分离,严重破坏了FⅧ基因的结构。早先Lakich和Naylor等[4]多应用Southern 印迹法检测内含子22倒位,操作周期长,过程复杂,且通常要使用同位素,而刘敬忠[5]等应用LD-PCR可快速检测该基因缺陷,它应用P,Q ,B 三种引物进行扩增,如果确为内含子22倒位,则患者呈11 kb一条带,携带者为11 kb,12 kb两条带,正常者为12 kb一条带,该法检测准确,且效率高。由于贵州省血友病家系对本病的认识普遍不高，故未能取得家系疑似携带者的标本，故本文仅就75例已经证实的HA患者进行内含子22倒位的检测,实验结果提示其中27例为内含子22倒位,占36% ,且均为重型血友病(FⅧ活性﹤1%)，与国内文献报道一致〔6]。27例检测出内含子22倒位的患者中有21例均有较明确的家族史，6例无家族史，有家族史的患者中内含子22倒位的发生率明显高于无家族史患者。重型HA患者中有家族史与无家族史患病率比较差异具统计学意义。由以上结果可以看出将内含子22倒位作为家系调查和携带者筛查具有一定可行性和实际价值。

表3　有、无家族史HA患者内含子22倒位发生情况及FⅧ活性比较

(1)与无家族史HA患者比较，χ2=4.81，P<0.05；(2)与无家族史HA患者比较，χ2=6.97，P<0.05

内含子1倒位是仅次于内含子22倒位导致重型HA的另一个重要分子发病机制[7]。目前认为，内含子1倒位发生率为1.2%～5%。国内首次大宗进行内含子l倒位筛查研究报道发现内含子1倒位占1.26%(2/158)[8]，本研究发现内含子1倒位1例，占1.33%，与国内外报道相符。内含子1倒位的发生率低，不作为首选家系调查和携带者筛查。

3个FⅧA 同源性高达99.9%的序列中, 包括了长达3.5 kb的GC含量为65%的GC岛, 尤其是其中近1 kb GC含量竟高达79%[9]，故扩增难度相当高，影响LD-PCR成败的因素很多。诸如引物浓度、酶用量、特殊定制dNTPs、基因组DNA的质量及用量、退火延伸温度及电泳分析等[5]。在实验过程中发现，同样的LD-PCR体系及条件下，部分标本可得到目的条带，另外部分标本多次PCR均未见目的条带，故推测在此实验中影响实验结果的关键在于基因组DNA的质量，采用盐析法及试剂盒提取DNA结果均不如意，酚-氯仿法仍是提取高质量DNA的经典方法，但操作过程很重要，每一步的手法必须轻柔，时间必须足够且可适当延长，并将饱和酚及氯仿∶异戊醇的步骤各增加一次，以得到纯度更高的DNA。通过提高DNA质量，原来未出现目的条带的标本均出现了目的条带。但实验的稳定性仍较差，考虑到LD-PCR体系加样极微量，实验室现有条件不能达到，严重影响加样的精确性，固采用混合加样后分装代替以前的逐个加样，实验的稳定性得到一定程度的巩固。

总之，目前LD-PCR是检测HA患者内含子22倒位的首选方法，内含子22倒位检测在重型HA的基因诊断及发病机理研究中具有重要意义，以后进一步扩大研究,明确该倒位对于患者家系优生优育的价值。

4参考文献

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Lakich D,Kazazian HH,Antonarakis SE,et al.Inversions disrupting the factor VIII gene as a common cause of severe hemophilia A[J].Nat Genet, 1993(2):236-241.

刘敬忠, 刘强, 梁燕,等.重型血友病甲基因诊断新技术的研究及其应用[J]. 高技术通讯, 1998(9):40.

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闫振宇.血友病A患者凝血因子Ⅷ抑制物的形成及其危险因素分析[D].北京：中国协和医科大学， 2007.

Naylor J , Buck D, Green P ,et al. Factor Ⅷ gene inversions in severe hemophilia A patients.Human Molecuar Genetics, 1995(4): 1217.

(2016-04-10收稿，2016-06-13修回)

中文编辑： 周凌； 英文编辑： 刘华

*通信作者E-mail:zengxiaoqing@hotmoul.com

[中图分类号]R554.11

[文献标识码]A

[文章编号]1000-2707(2016)07-0810-04

DOI:10.19367/j.cnki.1000-2707.2016.07.016

Analysis of Gene Inversion of Introns 22 and Introns 1 in 75 Patients with Hemophilia A

HUANG Gie1, ZHANG Jing2, LIU Yongmei1, YANG Fang3, ZENG Xiaojing1

(1.theAffiliatedHospitalofGuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China; 2.GuizhouCancerHospital,Guiyang550004,Guizhou,China; 3.GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China)

[Abstract]Objective: To observe the inversion of intron 22 and intron 1 in coagulation factor VIII gene of patients with hemophilia A(HA). Methods: Venous blood was taken from 75 cases of HA patients. Long range PCR amplification technology (LD-PCR) was adopted to detect intron 22 and intron 1 inversion. Two introns inversion occurrence was observed, and the intron 22 inversion proportion in severe HA patients was observed. The intron 22 inversion incidence was compared between patients of HA family history and no HA family history. Results: 27 patients with intron 22 inversion were found among the 75 patients, and detection rate was 36 %.All of 27 were severe HA patients, accounting for 57.4% of total 47 cases of severe HA patients(27/47) . In 27 cases, there were 21 cases with family history, and the incidence of intron 22 inversion was higher than that in patients with no family history (P<0.05). There was 1 case of intron 1 inversion, accounting for 1.3% (1/75). Conclusions: There is a higher probability of F VIII gene intron 22 inversion in severe HA patients, and intron 22 inversion detection has important significance in severe HA patients gene diagnosis.

[Key words]hemophilia A; coagulation factor VIII; gene inversion; diagnosis

网络出版时间：2016-07-17网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160717.1318.026.html