band3基因在斑马鱼早期胚胎中的表达*

庹媛媛， 尚鲁俊, 夏海雄, 何志旭，4**， 舒莉萍,,4**

(1.贵州医科大学 儿科教研室， 贵州 贵阳　550004； 2.贵州医科大学 免疫学教研室， 贵州 贵阳　550004； 3.贵州医科大学 实验动物中心， 贵州 贵阳　550004； 4.贵州医科大学 组织工程与干细胞实验中心， 贵州 贵阳　550004)



band3基因在斑马鱼早期胚胎中的表达*

庹媛媛1， 尚鲁俊2, 夏海雄3, 何志旭1，4**， 舒莉萍2,3,4**

(1.贵州医科大学 儿科教研室， 贵州 贵阳550004； 2.贵州医科大学 免疫学教研室， 贵州 贵阳550004； 3.贵州医科大学 实验动物中心， 贵州 贵阳550004； 4.贵州医科大学 组织工程与干细胞实验中心， 贵州 贵阳550004)

[摘要]目的： 用band3基因的反义mRNA探针进行斑马鱼全胚胎原位杂交，检测band3基因在野生型Tüebingen斑马鱼胚胎发育过程中的表达。方法： Trizol法提取斑马鱼胚胎总RNA并设计特异性引物，采用RT-PCR法扩增band3基因cDNA编码区片段；通过基因重组技术构建PBSK-band3重组质粒，用BamHⅠ酶切得到线性化PBSK-band3；以T7 RNA聚合酶转录合成反义地高辛标记的band3 RNA探针，用全胚胎原位杂交法检测band3基因在斑马鱼胚胎早期的表达情况。结果： 成功克隆band3基因片段，构建PBSK-band3重组质粒；经体外转录获得地高辛标记的反义band3 mRNA探针，原位杂交后检测证实band3基因在斑马鱼胚胎早期发育过程中间细胞群(ICM)和主动脉性腺中肾区(AGM)呈现高表达。结论： 地高辛标记的反义band3 mRNA探针可检测到斑马鱼胚胎中band3基因的定位表达。

[关键词]斑马鱼； 胚胎； band3； 全胚胎原位杂交； 探针

1材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物野生型Tüebingen斑马鱼品系由上海生命科学院健康研究所刘廷析研究员馈赠，本实验室繁殖培育。养殖条件：(28±2)℃，带有过滤系统的循环水系统养殖，12 h/d光照,予以草履虫及虾卵饲养[7]。

1.1.2主要实验试剂大肠杆菌Elico如DH5α由本课题组保存，PBSK质粒载体由上海生命科学院健康研究所刘廷析馈赠，Trizol试剂、逆转录试剂First.strand plus购自Invitrogen公司，高保真KOD-Plus PCR酶购自TOYOBO公司，限制性内切酶EcoR I和BamH I、T4 DNA连接酶以及DNA Marker均购自Fermentas公司，质粒小抽试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒购自北京天根生化科技有限公司，地高辛RNA标记和检测试剂盒以及NucAwaylM Spin Columns购自Ambion公司，BCIP/NBT购自VECTORLab。测序由北京诺赛公司进行。

1.1.3引物根据Genbank数据库提供的斑马鱼band3基因全长。用Primer Premier 5.0软件设计特异性扩增编码区片段的PCR引物。 PCR引物由京诺赛生物科技有限公司合成。上游引物P1为 5′-CGCGGATCCATTAAACGCCGCTACAAGCATTACC-3′，下游引物P2为5′ -CCGGAATTCGACGATCAGCCACATGCCCAC-3′；上游引物在起始密码ATG前下游引物在终止密码TAA前分别加入EcoRI和BamHI酶切位点。

1.2方法

1.2.1斑马鱼胚胎总RNA提取取斑马鱼胚胎,选取受精后0、18、24、36、48、72、96和120 h(hour post fertilization,hpf)的斑马鱼胚胎，各20枚，加入0.15 mL TRlzol试剂，充分匀浆。将斑马鱼8个时相胚胎的TRlzol匀浆室温放置5 min，4 ℃,12 000 r/min离心10 min后将匀浆并成1管，室温放置5 min,然后每毫升TRIzol试剂加入0.2 mL氯仿。剧烈振荡15 s，室温放置2 min。4 ℃,12 000 r/min离心15 min。转移上层水相至新的离心管中。加入0.5 mL的预冷的异丙醇，室温放置15 min沉淀RNA。4 ℃,12 000 r/min离心10 min。弃上清。加入1 mL 75%的乙醇。充分洗涤沉淀，4 ℃,12 000 r/min离心10 min。弃上清，加入1 mL预冷的75% DEPC无水乙醇，4 ℃,750 g/min离心5 min,弃上清。加入1 mL预冷的75% DEPC 无水乙醇，4 ℃,750 g/min离心5 min,弃上清。4 ℃,750 g/min离心5 min。弃多余的上清液。置空气中干燥(5～10 min)，沉淀溶于DEPC水中。

1.2.2扩增band3片段参考Thermo试剂盒说明，将总RNA逆转录生成cDNA,以此cDNA第一链作为模板.进行PCR扩增。PCR反应程序：95 ℃ 8 min(95 ℃ 40 s、56.4 ℃ 30 s、68 ℃ 30 s)，35个循环，68 ℃ 延伸10 min。PCR产物用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测,按北京天根生化科技有限公司的割胶回收试剂盒说明书操作回收300 bp左右的目的条带。

1.2.3band3表达载体构建及鉴定将割胶回收的band3 PCR产物和PBSK载体分别用EcoRI和BamHI酶酶切。通过T4连接酶将band3和PBSK载体连接重组，并送往北京赛诺公司进行测序鉴定。将测序正确的PBSK-band3重组质粒转化入DH5α宿主菌。经单克筛选后挑取单克隆，并提取质粒用EcoRI、BamH I进行双酶切鉴定。见图1。

图1　构建PBSK-band3重组质粒示意图Fig.1　Schematic diagram of PBSK-band3 recombinant plasmid

1.2.4地高辛标记的band3基因反义mRNA的制备将经测序和酶切鉴定正确的PBSK-band3重组质粒经BamHI酶酶切线性化之后，通过T7反义逆转录聚合酶制备反义band3基因反义mRNA 探针。用NucAwaylM Spin Columns纯化吸附柱回收Band3反义mRNA探针，经2%琼脂糖凝胶电泳鉴定后于-70 ℃保存备用。

1.2.5斑马鱼全胚胎原位杂交(whole mount in situ hybridization，WISH)收集Tuebingen野生型斑马鱼受精后0.75、3.75、6、9、12、18 、24、30、36、48和72 hpf共11个不同时相的胚胎，用3%多聚甲醛固定。用l×PBST溶液洗去多聚甲醛，用甲醇进行梯度脱水后，将胚胎置于68 ℃杂交炉中进行预杂交1 h，加人制备好的地高辛标记的band3反义mRNA探针，于68 ℃杂交炉中过夜，用不同浓度的SSCT将多余的探针洗去，加入地高辛抗体后过夜，用MABT将多余的抗体洗掉，加入BCIP/NBT染液对杂交胚胎进行染色，体视显微镜下观察并记录，用固定液对杂交胚胎进行再固定并且照相。

2结果

2.1band3基因扩增

可见到一特异性扩增带，位于200～500 bp，大小与预期的342 bp相符，见图2。

注： 1为DNA Maker，2为band3 PCR产物，3为空白对照图2　band3基因扩增Fig.2　hoxd3 gene amplification

2.2PBSK-band3重组质粒酶切鉴定与测序

用EcoR I和Xba I双酶切得到的band3基因片段约 300 bp，与RT-PCR产物大小一致；另外，得到的另1个DNA片段约3 000 bp，与PBSK质粒大小一致。 PBSK-band3重组质粒测序与band3基因完全一致。见图3、图4。

2.3地高辛标记的band3 反义mRNA探针的制备

将经BamH I单酶切的PBSK-band3重组质粒经地高辛标记后经T7逆转录成功制备反义mRNA探针，见图5。

2.4斑马鱼全胚胎原位杂交结果

Tuebingen野生型斑马鱼18～24 hpf胚胎的中中间细胞区(ICM,蓝色箭头所示)，30～48 hpf主动脉性腺中肾区(AGM,红色箭头所示)有蓝黑色阳性杂交信号band3 基因的表达。见图6。

3讨论

本实验利用斑马鱼这种模式生物研究band3基因，斑马鱼具有体积小，繁殖迅速，胚胎透明，可以实现目的基因的可失踪观察等生物学特点，是作为研究血液疾病研究的理想模式生物[8]。

WISH可以整体水平反映特定基因在胚胎发育过程中的时空表达情况，是研究胚胎发育过程中调控基因表达的常用技术。该技术成熟，地高辛所标记的探针具有较高灵敏度[9-10]，本实验通过设计斑马鱼band3基因片段的引物，提取斑马鱼胚胎总RNA，成功通过RT-PCR扩增出band3基因片段，将扩增的band3基因片段通过T4 DNA连接酶与载体PBSK质粒进行定向重组，得到PBSK-band3重组质粒，经过双酶切以及序列测定确定PBSK-band3重组质粒构建成功，并在此基础上以PBSK-band3重组质粒为模板进行T7体外转录，得到了片段为200 bp～500 bp的地高辛标记的band3反义mRNA探针，并进行斑马鱼全胚胎原位杂交技术观察band3反义mRNA探针在Tuebingen野生型斑马鱼胚胎早期发育过程中的时空表达情况。

band3基因表达的蛋白是红细胞膜上主要的蛋白，由3个亚基组成。是红细胞膜阴离子通道蛋白，也是Ser/Thr激酶的主要底物。本研究发现，band3基因在肾脏α-闰细胞和在心肌细胞中有所表达，说明band3基因与红系造血有关，其作用可能是助于红细胞提高二氧化碳的运输和维持形状。在某些导致红细胞破坏的疾病中，如地中海贫血、遗传性球形红细胞增多症、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症等[11-12]。Band3蛋白发生磷酸化的结构变化，破坏整个红细胞膜的蛋白结构，影响红细胞的脆性和变形能力，从而发生一系列病理反应。今后可以进一步研究band3的表达对红细胞膜结构的影响。

图3　PBSK-band3重组质粒测序Fig.3　PBSK-band3 recombinant plasmid sequencing

图4　PBSK-band3质粒的双酶切结果Fig.4　Results of double enzyme digestion of PBSK-band3 plasmid

注：1、2为反义band3 mRNA图5　地高辛标记的反义band3 mRNAFig.5　Digoxigenin-labeled antisense band3 mRNA

注：蓝色箭头所示ICM，红色箭头所示AGM图6　band3基因在野生型Tuebingen斑马鱼全胚胎中的表达Fig.6　Expression of band3 gene in wild-type TÜebingen zebrafish embryo

4参考文献

[1] Damien BR,Bernard P, Franck B,et al. Band 3 missense mutations and stomatocytosis: insight into the molecular mechanism responsible for monovalent cation leak[J]. Hindawi Publishing Corporation International Journal of Cell Biology, 2011:136802.

[2] Achille I, Luigia De Falco,Franck B. A novel erythroid anion exchange variant (Gly796Arg) of hereditary stomatocytosis associated with dyserythropoiesis[J]. Haematologica, 2009(8):1049-1059.

[3] Reithmeier RA, Casey JR, Kalli AC, et al. Band 3, the human red cell chloride/bicarbonate anion exchanger (AE1, SLC4A1), in a structural context[J]. Biochim Biophys Acta, 2016(7):1507-32.

[4] Gayani C, Kodippili, Spector J, et al. Imaging of the diffusion of single band 3 molecules on normal and mutant erythrocytes[J].Blood, 2009(113): 6237-6245.

[5] Southgate CD, Chishti AH,Mitchell B,et al.Targeted disruption of the murine erythroid band 3 gene results in spherocytosis and severe haemolytic anaemia despite a normal membrane skeleton[J].Nature Genetics, 1996(2):227-230.

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[9] Shu LP,Zhou ZW, Zhou T,et al. Ectopic expression of Hoxb4a in hemangioblasts promotes hematopoietic development in early embryogenesis of zebrafish[J]. Clin Exp Pharmacol Physiol, 2015(11):1275-1286

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(2016-05-03收稿，2016-06-26修回)

中文编辑： 文箐颍； 英文编辑： 刘华

*[基金项目]国家自然科学基金(31260284； 31360285)； 贵州省科技基础条件平台项目[(2009)4005]； 贵州省优秀科技省长专项基金(S2008-4)

[中图分类号]R321-33

[文献标识码]A

[文章编号]1000-2707(2016)07-0760-05

DOI:10.19367/j.cnki.1000-2707.2016.07.004

Expression Pattern ofBand3 during Zebrafish Early Development

TUO Yuanyuan1, SHANG Lujun2, XIA Haixiong2, HE Zhixu1,3, SHU Liping2,3,4

(1.DepartmentofPediatrics,theAffiliatedHospitalofGuizhouMedcialUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China;2.DepartmentofImmunology,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China; 3.LaboratoryAnimalCenter,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China; 4.TissueEngineeringandStemCellResearchCenter,GuizhouMedcialUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China)

[Abstract]Objective: The antisense mRNA probe of band3 gene was adopted to conduct Zebrafish whole embryos mount in situ hybridization to detect the expression of band3 gene in wild-type TÜebingen zebrafish embryonic development. Method: Zebrafish embryo total RNA was extracted by Trizol, specific primers was designed and the cDNA coding region fragment band3 was amplified by RT-PCR. The recombinant PBSK/band3 plasmids was constructed by recombination technique and linearized with BamH I enzyme digestion. T7 RNA polymerase was adopted to synthesize antisense band3 RNA probes labeled by digoxigenin. Zebrafish whole embryos mount in situ hybridization was adopted to detect band3 gene expression in early zebrafish embryos. Results: The band3 gene fragments were cloned and PBSK/band3 recombinant plasmid was constructed successfully. The digoxigenin-labeled antisense band3 probe was obtained in vitro transcription. After mount in situ hybridization, it was observed that band3 gene was highly expressed in the middle cell population (ICM) and the renal region (AGM) of the aorta gonad in the early embryonic development of zebrafish. Conclusion: In this study, we prepare the antisense mRNA band3 probe labeled with digoxigenin and detect the expression of band3 gene in zebrafish embryos.

[Key words]zebrafish; embryo; band3; whole embryo mount in situ hybridization; probe

**通信作者 E-mail:gyslp-456@163.com; hzx@gmc.edu.cn

网络出版时间：2016-07-17网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160717.1318.052.html