HPLC法同时测定紫珠叶中3种有效成分含量△

陈晓庆郑少燕陈庆奇*（.广州中医药大学第一附属医院　广州　50405；.南方医科大学附属佛山市妇幼保健院佛山　58000）

HPLC法同时测定紫珠叶中3种有效成分含量△

陈晓庆1郑少燕2陈庆奇2*（1.广州中医药大学第一附属医院广州510405；2.南方医科大学附属佛山市妇幼保健院佛山528000）

摘要：目的：建立同时测定紫珠叶中3种有效成分的高效液相色谱（HPLC）方法。方法：采用ZORBAX Extend-C18色谱柱（4.6mm× 250mm，5μm），流动相为乙腈-0.1%乙酸水（10∶90），梯度洗脱，流速为1mL·min-1，检测波长330nm，柱温30℃。结果：毛蕊花糖苷、木犀草素及芝麻素分别在46.325～926.5μg·mL-1（r=0.9998）、0.81～16.2μg·mL-1（r=0.9997）及0.6625～13.25μg·mL-1（r=0.9999）范围内线性关系良好，加样回收率98.8%～101.4%。结论：建立的HPLC法简便快速、重复性好、结果准确可靠，可作为紫珠叶药材质量标准控制的方法。

关键词：紫珠叶 HPLC有效成分 含量

紫珠叶为马鞭草科植物杜虹花Callicarpa formosana Rolfe的干燥叶，具有凉血收敛止血、散瘀解毒消肿之功效；用于衄血、咯血、吐血、便血、崩漏、外伤出血等症状［1］。研究表明紫珠叶含有毛蕊花糖苷、木犀草素、芝麻素［2］等成分，其中毛蕊花糖苷为苯丙素苷类化合物，具有增强中枢胆碱能功能和保护神经元细胞作用［3］；芝麻素具有良好的抗氧化能力［4］。木犀草素属于黄酮类化合物［5］，具有抗炎［6］、止血［7］作用，应是紫珠叶发挥散瘀止血之效的主要成分。但2015版《中国药典》仅对紫珠叶中毛蕊花糖苷含量做出规定，未对其他有效成分含量做出规定。因此本实验采用高效液相色谱法（HPLC）同时对紫珠叶中的3种有效成分进行测定，以完善紫珠叶质量标准。

1仪器与试药

Waters 2695型高效液相色谱仪（美国Waters公司），KQ-300DE型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），FA2004电子天平（上海恒平科学仪器有限公司），CX-500A型高速多功能粉碎机（上海市晟喜制药机械有限公司）。

6批次紫珠叶购自广东清平药材市场，经鉴定为马鞭草科植物杜虹花Callicarpa formosana Rolfe的干燥叶。

毛蕊花糖苷（批号：111530-201411，中国食品药品检定研究院）、木犀草素（批号：111520-201304，中国食品药品检定研究院）及芝麻素（购自美国Sigma公司）。乙腈、乙酸（色谱纯，Sigma公司），蒸馏水（自制），其余试剂均为分析纯。

2方法

2.1供试品溶液制备：将紫珠叶干燥、粉碎，过60目筛，精密称定2.0g，置于锥形瓶中，加入80%甲醇60mL，40℃下超声提取30min，冷却，补足失重。摇匀，0.45μm微孔滤膜过滤，即得紫珠叶供试品溶液。

2.2混合对照品溶液的制备：分别精密称取毛蕊花糖苷、芝麻素及木犀草素适量，置于同一100mL容量瓶中，加入80%甲醇定容至刻度，即得浓度为1.853、0.0324及0.0265mg/mL混合对照品溶液。

2.3色谱条件：ZORBAX Extend-C18色谱柱（4.6mm×250mm，5μm）；流动相：乙腈（A）-0.1%乙酸水（10∶90），梯度洗脱：0～5min，10%A；5～25min，10%～60%A；25～30min保持60%A；30～70min，60%～80%A；检测波长：330nm；流速：1.0mL·min-1；柱温：30℃；进样量：10μL。在该色谱条件下，5个待测成分色谱峰分离度均大于1.5，实验结果见图1A。

2.4线性关系考察：分别精密吸取“2.2”项下混合对照品溶液0.25、0.5、1.0、2.0及5.0mL至10mL容量瓶中，用80%甲醇定容至刻度，即得5个浓度的混合对照品溶液。按“2.3”项下选定的色谱条件进行测定，以对照品浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）绘制标准曲线，经计算得回归方程，结果见表1。

2.5精密度实验：将“2.2”项下混合对照品溶液连续进样6次，按“2.3”项下的色谱条件进行含量测定，记录峰面积，并进行计算，结果毛蕊花糖苷、木犀草素及芝麻素的RSD分别为0.88%、0.47%及0.76%。

2.6稳定性实验：将同一供试品液按“2.2”项下的色谱条件，分别于0、2、4、6、8、10h时各进样一次，记录其峰面积，计算各时间段毛蕊花糖苷、木犀草素及芝麻素峰面积的RSD为1.23%、0.98% 及1.54%，表明样品溶液在10h内稳定。

2.7重复性实验：精密称取同一批紫珠叶样品粉末各6份，按“2.1”项下供试品溶液制备方法制备供试品，按“2.3”项下的色谱条件进行含量测定，记录毛蕊花糖苷、木犀草素及芝麻素的峰面积，并进行计算，结果见表2，3种成分的RSD均小于2.0%，表明该实验的重复性良好。

表2紫珠叶中3种成分重复性实验结果Tab.2 Experimental results of 3 kinds of components

2.8加样回收率实验：精密称取1.0g已知含量的紫珠叶粉末6份，分别精密加入混合对照品溶液，按“2.1”项下供试品溶液制备法处理，依次测定，计算加样回收率及平均加样回收率。结果见表3至表5，毛蕊花糖苷平均加样回收率为101.4%，RSD为1.54%；木犀草素平均加样回收率为99.5%，RSD为0.83%；芝麻素平均加样回收率为98.8%，RSD为0.78%，表明该测量方法所得结果可行、可靠，能够满足测量需要。

表3毛蕊花糖苷加样回收实验结果Tab.3 Experimental results of Verbascoside

表4木犀草素加样回收实验结果Tab.4 Experimental results of Luteolin

表5芝麻素加样回收实验结果Tab.5 Experimental results of Sesamin

2.9样品的测定：取6个批次紫珠叶样品分别按照“2.1”项下每批次制备3份供试品溶液，按照“2.3”项下方法检测3种成分的含量，检测图谱见图1B，含量计算结果见表6。

表6样品的含量测定结果（n=3）Tab.6 The content determination results of samples（n=3）

3结论与讨论

3.1供试品溶液制备方法的确定：本实验分别考察了不同提取溶剂（甲醇、80%甲醇、乙醇及80%乙醇）、不同提取方法（超声及回流）以及不同提取时间（20、30、40及50min）对6种成分提取率的影响，结果发现采用60mL80%甲醇超声处理30min效果最佳，该条件下紫珠叶中6个有效成分提取率相对最高。

3.2检测波长的选择：对供试品在400～190nm波长范围内进行全波长光谱扫描，记录三维光谱图，经对各个波长的供试品色谱图进行比较，发现以330nm为检测波长，3个峰基线较平稳、分离效果好、响应值均较大，能较好反映样品中3个成分的信息。

3.3柱温的选择：本实验考察了不同柱温（25、30、35及45℃）对3个成分分离效果的影响，结果发现柱温控制在30℃时，3个成分与相邻色谱峰分离效果较好。

3.4测定结果分析：本实验考察了不同批次广西所产紫珠叶中3个有效成分的含量，由结果可知，紫珠叶中毛蕊花糖苷总量符合《中国药典》要求（不少于0.5%）［1］。3个有效成分的含量差异较大，其中毛蕊花糖苷的质量分数远高于其他两个成分。

本实验建立的HPLC方法操作简单、准确、重复性好，具有分离效果好、方法重复性好等诸多优点，为紫珠叶质量标准的完善提供理论基础。

参考文献

［1］中华人民共和国药典委员会.中国药典（第一部）［S］.北京：中国医药科技出版社，2015：320.

［2］任风芝，贺秉坤，栾新慧，等.紫珠叶的化学成分研究Ⅲ［J］.中国药学杂志，2004，39（1）：17-19.

［3］高莉，彭晓明，霍仕霞，等.毛蕊花糖苷改善D-半乳糖致亚急性衰老小鼠脑损伤的作用［J］.中草药，2014，45（1）：81-85.

［4］金青哲，刘元法，王兴国，等.芝麻素抗氧化性的初步研究［J］.中国粮油学报，2005，20（5）：89-92.

［5］余行，徐诗强，马冬晴，等.大叶紫珠总黄酮的提取工艺优选及其抗炎、镇痛及止血作用考察［J］.中国实验方剂学杂志，2013，19（12）：8-11.

［6］余行，徐诗强，马冬晴，等.大叶紫珠总黄酮的提取工艺优选及其抗炎、镇痛及止血作用考察［J］.中国实验方剂学杂志，2013，19（12）：8-11.

［7］Seelinger G，Merfort I，Schempp C M.Anti-oxidant，anti-inflammatory and anti-allergic activities of luteolin［J］.Planta medica，2008，74（14）：1667.

中图分类号：R285.5

文献标识码：A

文章编号：1672-8351（2016）07-0001-03

基金项目：△广东省科技厅产学研结合项目（2010B090400529）。

*通讯作者

Simultaneous determination of 4 active components in Callicarpae Formosanae Folium by HPLC method

Chen Xiaoqing1Zheng Shaoyan2Chen Qingqi2*（1.The First Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangdong Guangzhou 510405，PR China；2.Department of Pharmacy，Foshan Affiliated Maternal and Children’s Hospital of Southern Medical University，Guangdong Foshan 528000，PR China）

Abstract：Objective：Establish HPLC method for simultaneous determination of 4 active components in Callicarpae Formosanae Folium. Methods：Using a ZORBAX Extend-C18column（4.6mm×250mm，5μm），the mobile phase was acetonitrile and 0.1%acetic acid（acetic acid：water，10∶20），gradient elution，flow rate was 1mL·min-1，the detection wavelength was 330nm and the column temperature was 30℃.Results：Verbascoside，luteolin and sesamin in46.325～926.5μg·mL-1（r=0.9998）、0.81～16.2μg·mL-1（r=0.9997）and 0.6625～13.25μg·mL-1（r=0.9999）were with a good linear，recovery rate range from 98.5%to 100.9%.Conclusion：The established HPLC method is simple，rapid，reproducible，accurate and reliable，and can be used to control the quality standard of Callicarpae Formosanae Folium.

Key words：Callicarpae Formosanae Folium HPLC Effective components Content